【摘要】：1.基于数据挖掘的国医大师刘志明辨治冠心病(胸痹心痛病)组方规律目的:以传承整理刘志明教授治疗CHD心绞痛临证经验为切入点,对刘老治疗CHD心绞痛用药特点等进行挖掘,以期更好指导临床。方法:利用“中医传承辅助系统(V2.5)”软件,选择《刘志明医案精解》、《国医大师刘志明临证经验集》中符合CHD心绞痛纳入诊断标准病案资料。同时录入刘老首批学术传承人刘如秀教授于2018年12月至2019年2月于门诊进行诊治的CHD心绞痛患者验案;根据中医症状、用药等进行数据挖掘,人机结合,以期系统总结刘老治疗CHD的组方规律。结果:(1)频次分析表明,刘老治疗CHD心绞痛常用中药是薤白、瓜蒌、三七、茯岑、桑椹、太子参、制何首乌、炙甘草、生地黄、黄英、丹参、酸枣仁、枳壳、半夏等,以性甘温,归心、肾、脾、肺、肝经的药物为主。(2)通过用药模式分析,发现刘老治疗CHD心绞痛常通补兼施,以瓜萎、薤白通上焦心阳,以生地、桑葚、太子参、黄芪等滋肾补肾、养阴生津,用三七、丹参活血化瘀。(3)基于关联规则分析发现,制何首乌、茯苓→薤白,制何首乌、茯苓→桑椹,炒杏仁→桑椹,炒杏仁→三七、丹参,酸枣仁→生地黄、炙甘草,制何首乌→茯苓六个组合内药物和组合外药物之间的关联度最高,反映了刘老临床辨证治疗CHD心绞痛常用滋补肾阳、宣通阳气的治法,:善用瓜萎、法半夏、茯苓、三七、丹参等药物豁痰开窍,健脾化浊,活血化瘀。(4)采用新方分析,共挖掘9个药物核心组合,分别为:白芍-太子参-炙甘草,大枣-红参-白附子-炙黄芪-细辛,钩藤-牛膝-葛根-桑寄生-赤芍,山药-山茱萸-牡丹皮-地龙,山药-山茱英_枸杞子-瓜萎,柴胡-郁金-香附-红花,山茱萸-川芎-地龙-车前子,白芍-党参_西洋参-酸枣仁-太子参,麦冬-法半夏-生地黄-炒枳壳-制何首乌-太子参。(5)证候类型频次分析表明刘老辨治CHD证候类型以肾虚血瘀,心肾阳虚,气滞血瘀,胸阳不振最为常见。(6)药—证—症网络分析表明:患者主要症状表现、证候类型与刘老用药之间具有对应关系,如胸闷、胸痛、气短、乏力、腰膝酸软、畏寒、苔白厚、舌紫暗、脉沉细等组成的症状群,对应于肾虚血瘀证,与药物:制何首乌、瓜萎、薤白、桑椹、半夏、太子参、三七等密切相关,但由于中医证型兼杂出现,药物功效非唯一,因此”药—证—症”之间的对应关系呈现出复杂的网状关系。结论:数据挖掘结果与中医理论相契合。从肾论治是国医大师刘老治疗冠心病的核心学术思想。他认为肾虚为冠心病基本病机,血瘀为要素。在辨治冠心病时,要着眼于肾虚与血瘀的密切关系,补虚泻实、标本同治,灵活选用滋肾活血、补肾活血、益气温阳活血等相关中药进行加减化裁。2.滋肾活血方对缺氧/复氧心肌细胞和线粒体功能的影响目的:采用缺氧/复氧(H/R)条件造成H9C2细胞损伤,研究在H/R损伤中,滋肾活血方(ZSHX)对H/R心肌细胞和线粒体功能影响。方法:选择H9C2细胞为研究对象。(1)采用激光共聚焦观察线粒体荧光强度及线粒体膜电位;(2)采用Seahorse活细胞能量测定仪测量H9C2细胞的基础呼吸、最大呼吸率、ATP生成量、质子漏、呼吸控制率;(3)采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。结果:(1)不同浓度ZSHX均可增强缺氧复氧后线粒体荧光值(Low-dose ZSHX:220±6.16,Middle-dose ZSHX:256±6.89,High-dose ZSHX:302±6.02 vs.H/R 139±4.22,n=3,均P0.05)。提示缺氧/复氧造成心肌细胞活性线粒体数目减少,而加入不同浓度ZSHX均可增加活性线粒体数目。(2)H/R组细胞红色荧光值与正常组相比减弱,而绿色荧光增强(n=3,P0.05),说明H/R组的心肌细胞△Ψm 显著高于对照组。中、高浓度ZSHX红色荧光增强,而绿色荧光减弱(n=3,P0.05),说明中、高浓度滋肾活血方稳定△ Ψm,保护线粒体膜结构。(3)H/R组基础呼吸、最大呼吸、呼吸储备能力与正常组相比降低(基础呼吸:H/R:61.18±37.56 vs.Ctrl:100.72±7.57,n=4,P0.05;最大呼吸:H/R:141.38±45.17 vs.Ctrl:243.18±37.56,n=4,P0.05;呼吸储备能力:H/R:67.13±8.29 vs.Ctrl:147.17±10.29,n=4,P0.05),ATP 合成减少(H/R:38.17±17.76 vs.Ctrl:67.68±10.87,n=4,P0.05),质子漏增加(H/R:40.93±5.18 vs.Ctrl:27.17±8.92,n=4,P0.05)。而与H/R组相比,基础呼吸、ATP生成量随ZSHX浓度增加而增加,而高浓度的ZSHX增加最大呼吸(High ZSHX:196.42±39.77 vs.H/R:141.38±45.17,n=4,P0.05)。中浓度,高浓度ZSHX使线粒体呼吸储备明显上升(Middle ZSHX:95.54±20.98;High ZSHX:107.94±17.27 vs.H/R:67.13±8.29,n=4,P0.05),质子漏明显下降(Middle ZSHX:30.70±11.08;High ZSHX:27.94±12.26vs.H/R:40.93±5.18,n=4,P0.05)。(4)H/R组凋亡细胞百分率(70.91±4.57)与对照组(14.52±2.37)相比增加(n=3,P0.01)。而加入不同浓度的ZSHX会使H/R细胞凋亡比例显著下降(Low ZSHX:56.34±4.98 vs.H/R:70.91±4.57,n=3,P0.05;Middle ZSHX:33.70±4.08 vs.H/R:70.91±4.57,n=3,P0.01;High ZSHX:22.67±4.26 vs.H/R:70.91±4.57,n=3,P0.01)。3.滋肾活血方对缺氧/复氧心肌细胞mTORC1信号通路的影响目的:采用H/R条件造成H9C2细胞损伤,研究滋肾活血方对受损的H9C2细胞线粒体功能的改变,同时进一步探讨mTORC1信号通路在其中的调控作用。方法:选择H9C2细胞为研究对象。(1)利用流式细胞术检测胞内ROS水平、心肌细胞凋亡率;(2)采用Seahorse活细胞能量测定仪测量心肌细胞基础呼吸、最大呼吸率、ATP生成量、质子漏、呼吸控制率;(3)采用Q-PCR及免疫蛋白印迹法检测mTORC1通路相关蛋白(mTORC1、4E-BP、Raptor,P70s6k),磷酸化蛋白(p-mtor(S2448),p4E-BP1(Ser65)),脂肪酸氧化相关蛋白(CPT1A),ATP合成酶相关蛋白(ATP5D)在各组细胞中的mRNA及蛋白的表达变化。结果:(1)与对照组相比,H/R组细胞内ROS产生增加(78.31±6.14vs.34.53±6.10,n=3,P0.01),凋亡比例明显升高(78.91 ± 3.48 vs.13.83±3.57,n=3,P0.01)。滋肾活血方降低了 H/R造模后ROS合成,ROS值明显低于H/R组(52.31±6.01 vs.78.31±6.14,n=3,P0.05),同时使凋亡比例下降(18.24±4.17 vs.78.91±3.48,n=3,P0.01)。在滋肾活血方作用下,应用雷帕霉素(Rapa)抑制 mTOR 后,ROS 值明显增加(66.18±4.03 vs.52.31±6.01,n=3,P0.05);凋亡比例升高(26.84±3.26vs.18.24±4.17,n=3,P0.05)。(2)ZSHX使H/R组细胞线粒体基础呼吸上升、ATP合成量增加、质子泵漏下降、呼吸储备明显上升、最大呼吸明显上升(基础呼吸:ZSHX:87.50±7.89vs.H/R:65.12±15.26,n=4,P0.05)(ATP 合成量:ZSHX:45.10±3.99 vs.H/R:17.12±9.76,n=4,P0.05);(质子泵漏:ZSHX:42.55±5.89 vs.H/R:57.32±2.26,n=4,P0.05);(呼吸储备:ZSHX:69.91±8.27vs.H/R:60.13±18.29,n=4,P0.05);(最大呼吸:ZSHX:155.51 士 18.27vs.H/R:125.13±25.59,n=4,P0.05);而加入Rapa抑制mTORCl后,该线粒体保护作用消失,并且质子泵漏增加。(3)H/R组的mTOR、Raptor、p/mTORS2448mRNA及蛋白表达与对照组相比均有下降,4E-BP1及p/4E-BPlS65蛋白表达明显升高(n=3,P0.05);与H/R组相比,中剂量ZSHX组和高剂量ZSHX组mTOR、Raptor、p/mTORS2448蛋白及mRNA表达均升高(n=3,P0.05),而p70S6K表达未见变化。三组剂量ZSHX作用下,H/R造模后4E-BP1及p/4E-BPlS65mRNA及蛋白表达明显降低(n=3,P0.05)。(4)ZSHX使H/R组的ATP5D mRNA及蛋白表达上调,并且CPT1A的mRNA及蛋白表达下调(n=3,P0.05)。应用雷帕霉素抑制mTOR后,ATP5D的mRNA及蛋白表达减少,而CPT1A的mRNA及蛋白表达升高(n=3,P0.05)。结论:(1)滋肾活血方可能是通过提升缺氧复氧心肌细胞线粒体最大呼吸与呼吸储备能力,降低质子漏的产生,增加ATP,从而增强细胞应对损伤的能量储备能力,保护心肌细胞线粒体功能。(2)滋肾活血方对缺氧复氧心肌细胞的保护作用可能是通过降低线粒体膜电位及稳定线粒体膜结构、减少凋亡,维持缺氧复氧后心肌细胞的心脏功能。(3)滋肾活血方可通过激活mTORC1信号通路,抑制脂肪酸氧化,进而减少ROS生成,降低细胞凋亡,保护线粒体呼吸功能,促进ATP合成,从而保护心肌细胞免受损伤。
【图文】：
逑４．邋２药物四气五味频次分析逡逑图１Ａ所示，，１５０味药物中，寒性中药６７６次（４０．邋５５％）、平性中药６２４次逡逑（３７．邋４３％）、温性中药邋３５０邋次（２０．９９％）、凉性中药邋１７邋次（１．０１％）。逡逑图１Ｂ所示：１５０味中药中，辛：１７９次（７．３２％）、甘：１２８２次（５２．邋４７％）、逡逑苦：６６７邋次（２７．邋３％）、酸：２５３邋次（１０．邋３５％）、咸：２１邋次（０．８５％）、涩：４１逡逑次（１．６７％），甘味药居多，其次为苦、酸味，咸味最少，不足１邋％。逡逑、Ａ逡逑图１药物四气五味频次。Ａ：四气频次；Ｂ：五味频次逡逑４．邋３药物归经分析逡逑利用软件，统计纳入处方中的中药归经频次与百分比（共计４３４５次），脾逡逑８７１邋次（２０．邋０４％邋）、肺邋８６１邋次（１９＿邋８１邋％邋）、肝邋７４３邋次（１７．邋１％邋）、心邋７３２邋次（１６．邋８４％邋）、逡逑肾经６１０次（１４．０３％）药物比较常见。胃经、胆经、膀胱经、小肠经、大肠经逡逑药物少于１邋％，如图２所示。逡逑４２逡逑
８７１邋次（２０．邋０４％邋）、肺邋８６１邋次（１９＿邋８１邋％邋）、肝邋７４３邋次（１７．邋１％邋）、心邋７３２邋次（１６．邋８４％邋）、逡逑肾经６１０次（１４．０３％）药物比较常见。胃经、胆经、膀胱经、小肠经、大肠经逡逑药物少于１邋％，如图２所示。逡逑４２逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R249;R259;R285.5
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本文编号：
2600116
