脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型的建立与生物学基础的探索

发布时间：2020-04-14 04:14

【摘要】：研究背景肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是临床上最常见的功能性胃肠病(functional gastrointestinal disorders,FGIDs)之一。本病根据患者的大便性状可分为4个亚型,分别是腹泻型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)和不确定型(IBS-U)。本病具有发病率高、易反复发作的特点。IBS-D是IBS常见的亚型,约占所有IBS的23.4%～40%。脾肾阳虚证为IBS-D中医的主要证型之一。国内刘建平团队所做的文献综述显示:IBS-D的主要中医证型依次为脾胃虚弱证57.5%(23/40)脾肾阳虚证52.5%(21/40)=肝郁脾虚证52.5%(21/40)寒热错杂证29.6%(11/40)脾气虚证22.5%(9/40)。脾肾阳虚证同时也是2017年肠易激综合征中医诊疗专家共识意见中IBS-D的一个主要证型。团队前期临床研究发现,采用温肾健脾法治疗IBS-D具有疗效高、复发率低的临床优势,总有效率为92.24%,而安慰剂对照组仅为42.5%。前期实验研究发现,温肾健脾法通过改变IBS-D的肽类激素,影响结肠黏膜及回盲部肥大细胞脱颗粒,而发挥治疗作用。IBS具体发病机制不清,中医药治疗IBS具有优势,其取得疗效的基础是辨证论治。证候动物模型对中医病因病机学和证候演变规律研究、评价中药方剂疗效和阐释药理机制方面,具有不可或缺的作用。目前已经建立了肝郁脾虚证IBS-D大鼠模型,但作为临床上十分常见的脾肾阳虚证IBS-D的大鼠模型仍没有建立和进行系统评价。基于以上背景,为了更好的评估中药复方疗效,脾肾阳虚型IBS-D病证结合大鼠模型亟需建立。研究目的:通过番泻叶灌胃构建中医脾肾阳虚证,叠加IBS疾病公认的造模方法,构建出公认的脾肾阳虚证IBS-D的病证结合模型,并探索模型的生物学基础。为中药单体、复方的进一步研究提供动物模型基础。研究方法1.实验一构建脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型,番泻叶灌胃剂量和周期的探索采用母子分离法建立IBS疾病模型。以高、中、低番泻叶浓度(1.0g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml)灌胃,分别对应10g/kg·d、5g/kg·d和2.5g/kg·d的灌胃剂量,探索构建脾肾阳虚证所需的剂量和周期。高、中、低剂量灌胃以探索成模的最佳剂量。分别在灌胃的2、4、6周后进行取材,以探索成模最佳的灌胃周期。实验大鼠共计13组,每组10只,共计130只。分为母子分离+番泻叶高、中、低剂量组(灌胃的2、4、6周),共9组;正常组(灌胃的2、4、6周)共3组和复合组1组。复合组造模方法:每日疲劳游泳至力竭,灌服番泻叶5g/kg·d,并腹腔注射氢化可的松10mg/kg,1次/天,连续2周。观察大鼠皮毛变化,肛周情况,活动度和精神状态等一般情况。综合体重、饮食、腹泻情况、肛温、握力、负重游泳、腹壁撤退反射、D-木糖、尿-17羟、ACTH、CORT和病理以共同评价动物模型。2.实验二基于核磁共振技术,从代谢组学角度观察实验一模型构建过程中的尿液代谢轮廓和轨迹变化,筛出差异代谢物,找出代谢通路,对模型的生物学基础进行探索3.实验三基于16S rRNA测序,从肠道微生态角度探索实验一模型组和正常组的菌群差异4.实验四比较三种IBS造模方法(母子分离、直肠扩张、避水应激)联合番泻叶灌胃构建的脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型,优化出最佳的动物模型根据实验一结果,番泻叶灌胃可以构建出脾肾阳虚证。在番泻叶灌胃基础上,分别叠加母子分离、避水应激、直肠扩张三种常用的IBS疾病造模方法,通过比较,优化出最佳的病证结合动物模型。实验动物共计210只。分为母子分离组+番泻叶高、中、低剂量(灌胃的2、4、6周),共9组;直肠扩张+番泻叶高、中、低剂量(灌胃的2、4、6周),共9组;避水应激+番泻叶高、中、低剂量(灌胃的2、4、6周),共9组;正常组(灌胃的2、4、6周),共3组。一共30组,每组7只。模型评价指标:大鼠的一般状态、行为学改变、理化指标和病理。研究结果1.脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型番泻叶灌胃剂量和周期的探索高、中剂量番泻叶灌胃2～3天即可出现腹泻,番泻叶灌胃2周后,可明显出现粪便粒数和Bristol分型增加,低剂量组粪便粒数无明显增加。高、中剂量番泻叶灌胃出现大鼠体重增长减缓、进食减少、握力降低和负重游泳时间减少等变化。从灌胃剂量看,高剂量组此种变化更显著。对于握力和负重游泳,组间出现明显差异至少需要灌胃4周,提示达到阳虚需要更长时间灌胃。肛温随灌胃时间的延长呈现降低的趋势,但在6周才出现明显的差异。从血清和尿液激素水平看,高剂量番泻叶灌胃4周可引起尿-17羟和CORT的降低,ACTH虽有降低,但未得出统计学差异。肛温的显著差异也发生在高剂量番泻叶灌胃6周,由此可见,高剂量灌胃4周可以引起部分脾肾阳虚的改变,但高剂量番泻叶灌胃6周更能充分表现出脾肾阳虚。且灌胃6周,未引起肠组织明显的病理变化。复合因素造模虽可使大鼠出现腹泻,体重降低和握力、负重游泳等自主活动能力明显降低,但出现了大鼠的明显死亡和肠道局部组织粘连现象。造模方法有悖于中医的病因理论,也不符合IBS-D的功能性肠病的特点。而且操作复杂,不利于模型的重复。综合以上分析,高剂量番泻叶灌胃6周叠加母子分离法是构建脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型较为合适的造模方法。2.基于代谢组学角度探索脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型的生物学基础从大鼠尿液代谢轮廓分析可见,番泻叶灌胃前,母子分离组和正常组的尿液代谢轮廓即显现出差异,提示母子分离法具有诱导IBS疾病模型的作用。番泻叶灌胃2、4、6周后,从灌胃的剂量来看,均是高剂量组的代谢改变最为明显。进一步进行高剂量2、4、6周的对比,发现高剂量灌胃6周的代谢改变最为明显。高剂量番泻叶灌胃6周联合母子分离法应为构建脾肾阳虚证IBS-D最佳的造模剂量和时间。在造模的过程中,上调的差异代谢物主要有:肌酸、尿囊素、马尿酸盐、丙酸盐、牛磺酸及3-吲哚硫酸酯6个,下调的差异代谢物主要有:乙醇、酮戊二酸、顺乌头酸、N-乙酰天冬氨酸及甲酸盐5个。具体涉及的代谢通路包括:牛磺酸和亚牛磺酸代谢;乙醛酸和二羧酸代谢;柠檬酸循环。这些通路和机体能量代谢、应激相关代谢、肠道菌群、胆汁酸代谢密切相关。3.基于肠道微生态角度探索脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型的生物学基础和正常组大鼠粪便菌群相比,母子分离联合高剂量番泻叶灌胃6周构建的脾肾阳虚证IBS-D模型有如下特征:从菌群的相对丰度来看,可见模型组和正常组前三位的菌群均为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门。但模型组呈现厚壁菌门增加,拟杆菌门减少趋势。厚壁菌门/拟杆菌门的比值增高与稀便呈正相关。物种多样性曲线可见,正常组和模型组的菌群多样性差异不大,模型组物种多样性无明显改变,这也符合IBS-D属于功能性疾病的特点。基于OTU的Venn图可得,模型组和正常组共有的OTU有725个,模型组特有的OTU有25个,正常组特有的OTU有24个。也从侧面反映了正常组和模型组的多样性差异不大。差异物种分析可见,T-test:在科(family)水平上看,正常组瘤胃球菌高于模型组。在属(genus)水平看,正常组未确定的瘤胃球菌属、Dubosiella菌属高于模型组。模型组颤螺菌属、Papillibacter菌属水平高于正常组。LefSe:正常组瘤胃球菌、未确定的瘤胃球菌高于模型组。模型组罗伊氏乳杆菌高于正常组。4.(母子分离、直肠扩张、避水应激)联合番泻叶灌胃构建脾肾阳虚证IBS-D的比较基于内脏高敏感、腹泻和脾肾阳虚证(行为学和理化指标)三个方面对构建的大鼠模型进行评价,根据对大鼠的AWR测定,三种IBS疾病造模方法都能较好的复制大鼠的内脏高敏感。番泻叶灌胃的浓度可能和AWR评分呈正相关。腹泻的程度和番泻叶灌胃呈现明显的剂量相关性,即高剂量组的大鼠腹泻最为明显。对于脾肾阳虚的证候指标的评价:行为学指标包括体重增长减缓、进食减少、握力降低、肛温降低和负重游泳时间减少;理化指标包括血清D-木糖和激素水平。实验发现,出现握力降低和负重游泳时间减少,番泻叶灌胃时间至少需要4周。高、中剂量灌胃4周可出现一些脾肾阳虚的行为学变化,但较6周相比,阳虚指标随着灌胃时间的延长呈现进一步加重的趋势。另外,从造模因素反推来看,番泻叶灌胃只要可以持续的引起腹泻,就会久泻伤阳,导致阳虚逐渐加重。直肠扩张和母子分离联合高剂量番泻叶灌胃6周均能稳定的构建脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型,但两者从数值比较,直肠扩张组更为明显。故6周高剂量番泻叶灌胃叠加直肠扩张为最佳的脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型。研究结论1.研究一采用单味中药番泻叶“苦寒泻下,日久伤阳”构建脾肾阳虚证,造模方法相对简单,探索了构建脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型需要番泻叶灌胃的剂量和周期,即最佳剂量为高剂量组,最佳灌胃周期为6周。2.代谢组学技术可以动态观察构建出脾肾阳虚证IBS-D大鼠造模过程中的尿液代谢变化及其随时间的尿液代谢变化轨迹。模型组和正常组相比,在能量代谢、应激相关代谢、肠道菌群、胆汁酸代谢发生了代谢信息改变,有利于对动物模型进行客观评价。基于肠道微生态,有利于发现差异物种,联合应用其他系统生物学技术,对于研究病证结合模型,深化疾病和证候的生物学基础具有重要意义。3.通过对三种造模方法(母子分离、直肠扩张、避水应激)联合番泻叶灌胃构建脾肾阳虚证IBS-D进行比较,高剂量组番泻叶灌胃6周联合直肠扩张组复制的病证结合模型最好(从实验数值来看),其次是母子分离,避水应激成模相对较差。
【图文】：

示意图,示意图,压力,球囊扩张

观察大鼠腹壁对肠腔球囊扩张刺激的反应。ＣＲＤ的压力从ｌＯｍｍＨｇ开始，以ｌＯｍｍＨｇ逡逑压力递增，分别采用２０、４０、６０和８０ｍｍＨｇ四个压力，每次扩张持续２０ｓ，，每个压力测逡逑２？５次，间隔４ｍｉｎ，取评分均值具体评分标准详见图２和表６。逡逑１逦３逡逑＼逦Ｘ逦逦＊逦逦逦逡逑２逦４逡逑图２邋ＡＷＲ示意图逡逑５８逡逑

药物制备,测压计,灌胃,针尾

压计的束缚带拆除，将灌胃针针尾固定在橡胶管的一侧，截取长约５ｃｍ的橡胶手套套在逡逑灌胃针上作为气囊，用手术线扎牢，最后用三通管将其连接，并确保充气后水银柱不下逡逑降。如图３所示：逡逑６９逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R259;R-332

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