清肠化湿法介导MSCs调控miR-21治疗溃疡性结肠炎的机制研究

发布时间：2020-05-11 22:10

【摘要】：目的研究清肠化湿法介导MSCs,通过IL-6/STAT3通路调控miR-21的表达治疗溃疡性结肠炎具体机制,并解析其组方药物主要活性成分没食子酸的作用机制,进一步探讨清肠化湿法治疗溃疡性结肠炎的科学内涵。方法体外实验:分离和培养大鼠骨髓MSCs,运用倒置生物显微镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定细胞表面标志物,并诱导其成脂分化,鉴定所提细胞种类。采用CCK8法检测自提MSCs细胞增殖情况,确定后续实验清肠化湿复方干预浓度。后续实验分为MSCs空白组,LPS诱导MSCs细胞所得的炎症模型组,运用清肠化湿复方干预MSCs炎症模型所得的中药组,经STAT3抑制剂NSC74859处理MSCs细胞所得的抑制剂组,经STAT3抑制剂NSC74859处理MSCs炎症模型所得的模型+抑制剂组,以及清肠化湿复方和STAT3抑制剂NSC74859共同处理MSCs炎症模型所得的中药+抑制剂组。采用ELISA法检测各组细胞上清液IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10、TGF-β炎性因子的水平,RT-qPCR法检测各组细胞miR-21、STAT3 mRNA的水平,Western Blot法检测各组细胞p-STAT3蛋白的表达情况。采用HPLC法同时测定清肠化湿复方中盐酸小檗碱、没食子酸及黄芩苷,采用CCK8法检测没食子酸IC50值,确定高中低中药组浓度。设立空白对照组及LPS诱导的MSCs炎症模型组,采用流式细胞仪检测各组细胞周期及凋亡情况,细胞划痕及Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力,运用ELISA法检测各组细胞上清液IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10、TGF-β的水平,RT-qPCR法检测各组细胞miR-21、STAT3 mRNA的水平,Western Blot法检测各组细胞p-STAT3蛋白的表达情况。体内实验:TNBS法建立大鼠溃疡性结肠炎模型,60只大鼠随机分为空白组,TNBS诱导的模型组,在模型组基础上经尾静脉输注1ml 1× 106个/ml第三代MSCs细胞悬液的MSCs组,在MSCs组基础上给予清肠化湿复方水煎液13.6g/kg灌胃的复方组,以及在复方组基础上腹腔注射5mg/kg STAT3抑制剂NSC74859的复方+抑制剂组。观察结肠黏膜大体形态及组织病理学改变,采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-6的水平,RT-qPCR法检测各组大鼠结肠组织miR-21、STAT3 mRNA的水平,Western Blot法检测各组大鼠结肠组织p-STAT3蛋白的表达情况。结果体外实验:经鉴定,自提细胞符合MSCs细胞特征。与空白组相比,模型组经LPS诱导后促炎细胞因子IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α的水平升高,而炎症抑制因子IL-10和TGF-β的水平则降低,miR-21、STAT3 mRNA的水平升高,p-STAT3蛋白的表达量升高。与模型组相比,中药组经清肠化湿复方干预治疗可以降低IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α的水平,提高IL-10和TGF-β的水平,降低miR-21、STAT3 mRNA的水平,且能够降低p-STAT3蛋白的表达量。成功建立了HPLC同时测定清肠化湿复方中三种活性成分盐酸小檗碱、没食子酸及黄芩苷的系统条件。与空白组相比,模型组可造成MSCs细胞周期S期阻滞,凋亡增加,迁移和侵袭能力减弱。与模型组相比,运用没食子酸干预处理的中药组可缓解MSCs的细胞周期阻滞,减少凋亡,增强其迁移侵袭能力,同时可以降低IL-6、IL-lβ、IL-17、TNF-α的水平,提高IL-10和TGF-β的水平,降低miR-21、STAT3 mRNA的水平,降低p-STAT3蛋白的表达量,且呈剂量依赖效应。体内实验:与模型组及MSCs组相比,复方组对结肠黏膜大体情况及组织病理学改变有更好的缓解作用,且能够更好的降低大鼠血清IL-6的水平,降低结肠组织miR-21、STAT3 mRNA的水平以及p-STAT3蛋白的表达量。结论成功构建并优化了大鼠骨髓MSCs分离和培养体系。证明了清肠化湿法可以缓解MSCs炎症模型的炎症反应,降低促炎细胞因子的水平,提高炎症抑制因子的释放,维护其免疫调节功能。同时清肠化湿法可以介导MSCs,具体机制可能是通过IL6/STAT3通路调控miR-21的水平,从而提高治疗溃疡性结肠炎的疗效。清肠化湿法主要活性成分没食子酸可以改善MSCs炎症细胞模型细胞周期阻滞,减少细胞凋亡,增强迁移和侵袭能力,可能介导MSCs通过IL-6/STAT3通路调控miR-21的水平,为中医药临床治疗溃疡性结肠炎提供了科学依据。
【图文】：

图１邋ＩＬ６／ＳＴＡＴ３信兮通路逡逑

逦第二部分实验研究逦逡逑４．２自提骨髓ＭＳＣｓ表面标记物鉴定逡逑经流式细胞仪检测，提取所得的细胞高表达间质细胞表面标志物ＣＤ２９邋（７８．４％）、逡逑ＣＤ９０邋（８５．４％）、ＣＤ１０６邋（９５．５％），而不表达造血细胞表面标志物邋ＣＤ３１邋（１．１２％）、ＣＤ３４逡逑（４．４８％）、ＣＤ４５邋（２．６８％），，符合间充质干细胞特性。逡逑１Ｋ－］逦ｔｔｃｊ逦１Ｋ邋ｊ逦＿＊邋Ｋ＂￣逡逑Ｉ逦？；．逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R259

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本文编号：2659141