基于骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱转化及活性探讨维药骆驼蓬籽炮制机理

发布时间：2017-03-26 16:00

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【摘要】：骆驼蓬(Peganum garmala L.3)为蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum)多年生草本植物,种子和全草均可入药。用于治疗咳嗽气喘、风湿痹痛、无名肿痛、风湿痹痛等症,是维吾尔族、蒙古族、哈萨克族沿用已久的民族药材。骆驼蓬在我国资源丰富,分布广泛,是极具开发价值的药用植物资源。骆驼蓬种子中的药用成分较高,目前新疆医科大学第二附属医院制备的骆驼蓬片是骆驼蓬在临床上应用的医院制剂,用于治疗消化道肿瘤,多年来的临床实践证明该制剂安全、可靠、有效。骆驼蓬种子中的主要活性成分为生物碱类化合物,具有广泛的药理活性,尤其具有显著的抗肿瘤作用。前期研究表明,骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱是骆驼蓬种子中含量最高的两种生物碱,也是主要的生物碱活性成分。骆驼蓬有小毒,传统使用中需要对骆驼蓬籽进行炮制。维医、蒙医和哈萨克医使用骆驼蓬籽进行临床治疗时,常用酒浸泡后使用,确保临床用药的安全性和有效性,也有文献零星报道,骆驼蓬的使用前要炒制。目前,我国对骆驼蓬籽的炮制研究较少,且炮制前后骆驼蓬籽中的化学成分变化尚不清楚。基于此,本论文选择骆驼蓬籽中的主要化学成分骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱,考察炒制前后骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的含量变化,并通过植物细胞悬浮培养体系探究两者转化的可能性。采用液质联用技术对转化后成分去氢骆驼蓬碱进行肝微粒体酶代谢研究,同时,比较骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的体外抗肿瘤活性以及去氢骆驼蓬碱对细胞迁移的抑制作用,推测维药骆驼蓬籽的炮制机理。一、 骆驼蓬籽中两种生物碱提取分离工艺及质谱裂解规律研究骆驼蓬籽,粉碎过筛,石油醚脱脂。脱脂后根据酸溶碱沉法得总生物碱。对总生物碱进行硅胶柱层析,洗脱剂：二氯甲烷-甲醇,点板合并、甲醇结晶得化合物粗品,反复柱层析,甲醇重结晶后得化合物1和化合物2,经鉴定化合物1为去氢骆驼蓬碱,化合物2为骆驼蓬碱。采用液质联用的方法研究骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的质谱裂解机制。将两种生物碱通过HPLC进行分离后,在正离子模式下,得到骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的质谱图。解析发现去氢骆驼蓬碱多级质谱和骆驼蓬碱多级质谱呈现相同的裂解规律,即其裂解主要是吡啶环上发生的RDA裂解以及吲哚环上取代基呈现的-CH3和-OH等自由基丢失,而吲哚环本身相对稳定。采用静态吸附实验模型,以骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的吸附率和解吸率为指标,从D101、LSA-5b、LSD-001三种大孔树脂中筛选出LSA-5b大孔吸附树脂为纯化骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的树脂。分别从样品pH值、样品浓度、上样流速、乙醇洗脱浓度、洗脱流速、洗脱剂用量方面优化了树脂对骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的吸附和洗脱工艺条件。得到最佳的吸附条件是：上样溶液pH值为9、样品浓度为0.6g生药/mL、上样流速为2BV/h-最佳洗脱条件为：70%乙醇作为洗脱剂、洗脱流速为1.5 BV/h、洗脱剂用量为6BV；在最佳纯化工艺条件下骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的转移率可达70%以上,工艺稳定可靠。二、基于骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的炮制机理研究骆驼蓬籽炒制前后骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的含量变化分析。取净骆驼蓬籽,置预热的炒制容器内,用文火加热,炒至微鼓起,有香气逸出,取出,放凉,备用,得骆驼蓬籽炒制品,通过HPLC测定骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的含量。结果发现,生品中去氢骆驼蓬碱的含量为72μg/g,骆驼蓬碱的含量为219μg/g；炒制品中去氢骆驼蓬碱的含量为125μg/g,骆驼蓬碱的含量为193μg/g。炒制后骆驼蓬碱的含量降低,去氢骆驼蓬碱的含量升高。植物细胞悬浮培养体系对骆驼蓬碱的生物转化研究。为了探讨骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的转化,论文采用植物悬浮细胞体系对骆驼蓬碱的生物转化进行了相关研究。培养长春花、一叶蔌和烟草的植物悬浮细胞培养体系,加入底物去氢骆驼蓬碱乙醇溶液后继续培养至收获。应用薄层色谱法和质谱法对转化产物进行检识。结果显示骆驼蓬碱在该植物悬浮细胞培养体系中发生生物转化,且转化产物为去氢骆驼蓬碱。去氢骆驼蓬碱在人肝微粒体中代谢产物研究。采用高效液相色谱-离子阱-质谱系统,对去氢骆驼蓬碱进行人肝微粒体代谢实验研究,平行建立2份去氢骆驼蓬碱的肝微粒体酶孵化体系,反应终止后,采用LC-MS-MS检测代谢产物。结果显示去氢骆驼蓬碱色谱峰与空白肝微粒体中的杂质峰及去氢骆驼蓬碱代谢产物峰达到良好分离,通过质谱分析去氢骆驼蓬碱的代谢产物为哈尔醇。去氢骆驼蓬碱及骆驼蓬碱体外抗肿瘤活性比较研究。通过CCK-8法观察去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱对细胞增殖的抑制作用,细胞迁移实验观察去氢骆驼蓬对Hela细胞的迁移抑制情况,结果发现去氢骆驼蓬碱的半数致死量IC50约为7.549μg·mL-1,去氢骆驼蓬碱浓度为20μg·mL-1,时对Hela细胞的抑制率最大。骆驼蓬碱的半数致死量IC50约为38.67μg·mL-1,抑制率在骆驼蓬碱浓度为80μg·mL-1时最大。细胞迁移实验结果显示,去氢骆驼蓬碱能显著抑制Hela细胞扩散,浓度在0-2μg·mL-1范围内抑制作用明显,随着用药浓度的增高呈现出较强的抑制作用。三、不同炮制方法中骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱含量变化研究对骆驼蓬籽酒制得骆驼蓬籽酒制品,通过HPLC测定生品和酒制品中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的含量。酒制品中去氢骆驼蓬碱的含量为115μg/g,骆驼蓬碱的含量为199μg/g。去氢骆驼蓬碱在不同炮制方法中的含量不同,且炒制品酒制品生品。
【关键词】：肝微粒体 抗肿瘤 骆驼蓬 骆驼蓬碱 炮制 去氢骆驼蓬碱 生物转化
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R29
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 符号说明13-14
• 文献综述 骆驼蓬研究现状14-37
• 1 骆驼蓬的植物学研究资料总结14-22
• 2 骆驼蓬的生物活性研究22-28
• 3 骆驼蓬的毒性研究28
• 4 骆驼蓬在临床上的应用28-29
• 5 骆驼蓬的炮制研究29
• 6 小结29-30
• 参考文献30-37
• 前言37-39
• 第一章 骆驼蓬籽中两种生物碱提取分离工艺及质谱裂解规律研究39-58
• 第一节 骆驼蓬籽中两种生物碱的提取分离39-47
• 1 仪器与材料39-40
• 2 提取与分离40
• 3 结构鉴定40-46
• 4 小结46-47
• 第二节 骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的质谱裂解途径分析47-51
• 1 仪器与材料47
• 2 实验方法与结果47-50
• 3 讨论50
• 4 小结50-51
• 第三节 大孔吸附树脂法富集分离的工艺研究51-58
• 1 实验材料51
• 2 实验方法与结果51-56
• 3 讨论56-57
• 4 小结57-58
• 第二章 基于骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的炮制机理研究58-79
• 第一节 骆驼蓬籽炒制前后骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱含量变化分析58-64
• 1 仪器与材料58-59
• 2 方法与结果59-62
• 3 讨论62-63
• 4 小结63-64
• 第二节 植物细胞悬浮培养体系对骆驼蓬碱的生物转化64-69
• 1 仪器与材料64-65
• 2 方法与结果65-67
• 3 讨论67-68
• 4 小结68-69
• 第三节 去氢骆驼蓬碱在人肝微粒体中代谢产物研究69-74
• 1 仪器与材料69-70
• 2 方法与结果70-72
• 3 讨论72-73
• 4 小结73-74
• 第四节 去氢骆驼蓬碱以及骆驼蓬碱体外抗肿瘤活性比较74-79
• 1 仪器与材料74
• 2 方法与结果74-77
• 3 讨论77-78
• 4 小结78-79
• 第三章 不同炮制法对去氢骆驼蓬碱的含量分析79-82
• 1 仪器与材料79
• 2 方法与结果79-81
• 3 讨论81
• 4 小结81-82
• 结语82-85
• 参考文献85-87
• 致谢87-88
• 在学期间主要研究成果88

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1 许招懂,潘启超;骆驼蓬碱抗癌作用研究[J];癌症;1989年02期

2 王晓华,王宏,何安光;骆驼蓬碱抗肿瘤作用的体外研究[J];中国医科大学学报;1993年03期

3 王锦军;龚道凯;张秀梅;张敬芳;杨希雄;杨成雄;;超临界二氧化碳萃取骆驼蓬种子脂肪油与去氢骆驼蓬碱工艺的实验[J];中成药;2006年09期

4 徐英宏;姜清华;段旭;李Z

本文编号：269001