核受体辅助因子与绝经后骨质疏松症骨与肌肉代谢关联性及补肾健脾化瘀方的协同干预研究

发布时间：2020-06-09 00:16

【摘要】：的改善作用,并能一定程度增加肌力及肌肉含量。综上,本课题希望从核受体及其辅助因子SRC-3及PGC-1 α为切入点研究其可能在肌肉代谢中发挥的作用及其在骨与肌肉代谢相互影响的过程中发挥的作用,尝试为阐明绝经后骨质疏松的发病机制及骨质疏松患者骨与肌肉代谢交互调节的详细机理提供理论基础。并进一步研究补肾健脾化瘀方对骨质疏松中骨骼与肌肉代谢异常的协同干预效果和作用机理,证实中药防治骨质疏松的疗效,为临床采用中医药疗法治疗骨质疏松提供新的理论依据。下面将对本课题的研究目的、方法、结果和结论进行分别阐述:目的探讨SRC-3、PGC-1 α在PMOP患者骨与肌肉代谢中的作用及可能联系;观察补肾健脾化瘀中药复方对去势骨质疏松大鼠骨与肌肉代谢异常的协同干预作用及可能机制。方法1临床研究:本研究属横断面研究,以PMOP患者为研究对象,采集受试者外周血并测定骨密度、肌力、肌肉含量,通过酶联免疫吸附法(ELISA)等方法,检测血清SRC-3和PGC-1 α水平,研究SRC-3和PGC-1 α与患者骨与肌肉代谢水平的相关性,并探讨肌肉功能改变在绝经后骨质疏松患者病理过程中的作用。2动物研究:以去卵巢骨质疏松大鼠为模型,以中药补肾健脾化瘀方为工具药,通过DXA测量骨密度、网格实验测定肌力、骨与肌肉组织切片检测形态学、ELISA检测外周血、肌肉、骨骼组织中SRC-3、PGC-1 α等蛋白含量,实时荧光定量核酸扩增检测(QPCR)检测肌肉中Wnt/β-catnin信号通路相关mRNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western-blotting)检测MAPK通路相关蛋白表达,探讨核受体辅助因子SRC-3、PGC-1 α在去卵巢大鼠骨与肌肉代谢异常中的可能作用及补肾健脾化瘀方对去卵巢大鼠骨丢失与肌肉代谢异常的干预作用及可能机制。结果1 SRC-3和PGC-1 α在PMOP患者骨组织和血清中的表达水平及意义1.1 PMOP患者血清SRC-3和PGC-1 α表达水平与各部位骨密度相关性53例受试对象血清SRC-3水平与肌力、腰椎BMD、左股骨颈BMD、左股骨上端BMD正相关,相关性具有统计学意义(P值均0.01)。血清PGC-1 α水平与肌力、腰椎BMD、左股骨颈BMD、左股骨上端BMD正相关,相关性具有统计学意义(血清PGC-1 α水平腰椎BMD相关性p值均0.05,其余各项p值均0.01)。1.2 PMOP患者肌力、骨密度及体内SRC-3和PGC-1 α水平相关性根据受试者肌力水平,将之分为肌力正常组(4-5级)与肌力减弱(0-3级)组。肌力正常组共36例,肌力减弱组共17例。两组之间年龄的差异不具统计学意义。肌力减弱组的血清SRC-3、PGC-1 α水平较肌力正常组为低,差异具有显著性(p0.01)。肌力减弱组的腰椎BMD较肌力正常组为低,差异具有统计学意义。(p值分别为0.032,0.018均0.05)肌力减弱组的左股骨颈BMD、左股骨上端BMD均较肌力正常组为低,差异具有显著性(p0.01)。2核受体辅助因子SRC-3、PGC-1α与去卵巢SD大鼠骨质疏松骨与肌肉代谢关联性及补肾健脾化瘀中药复方对其的联合干预作用2.1各组动物体质量、肌力及肌肉含量变化情况给药前各组大鼠间体质量比较,差异不具有统计学意义(p0.05)。给药全程每30天为节点对各组大鼠间进行体质量比较,差异均无统计学意义(p0.05)。给药90天后各组大鼠间体肌肉含量组间横向比较,BSZY、EV及RLX组给药90天肌肉含量均高于OVX组,但低于Sham组,差异具有统计学意义(p均0.05)。给药180天各组大鼠间体肌肉含量组间横向比较,差异不具有统计学意义(p0.05)。给药90、180天节点各组动物肌肉含量组内纵向比较,差异均不具有统计学意义(p0.05)。2.2骨组织形态学给药90天后OVX、BSZY、EV、RLX组大鼠骨小梁均出现不同程度的病理变化,与骨密度检测结果一致。0VX组骨小粱大面积减少,部分区域稀疏变细且分布不均,骨小梁间隙增大。Sham组可见骨小粱密集、排列较整齐、仍能连接成网,骨小梁间隙较小,骨小梁形态结构尚完整,骨细胞细胞核清晰可见。与OVX组比较,BSZY、EV、RLX组可见骨小梁数量较OVX组为多,部分区域骨小梁连接性尚可.2.3各组动物血清、骨骼与肌肉组织中SRC-3与PGC-1α比较给药90天及180天时,OVX、BSZY、EV及RLX组血清SRC-3与PGC-1 α水平均高于OVX组,差异具有显著性(p均0.001)。BSZY、EV、RLX组血清SRC-3与PGC-1α水平均低于Sham组,差异具有显著性(p均0.001)。而BSZY、EV、RLX三组间血清SRC-3与PGC-1 α水平的差别没有统计学意义(p=0.412)。给药90天及180天时,OVX、BSZY、EV及RLX组骨组织SRC-3与PGC-1α水平均低于Sham组,差异具有显著性(p均0.001)。BSZY、EV、RLX组骨组织SRC-3与PGC-1α水平均高于OVX组,差异具有显著性(分别为p=0.013,p=0.004,p0.001)。而BSZY、EV、RLX三组间骨组织SRC-3与PGC-1 α水平的差别没有统计学意义(p=0.061)。给药90天及180天时,OVX、BSZY、EV及RLX组肌肉组织SRC-3与PGC-1 α水平均低于 Sham 组,差异具有显著性(p0.001,p=0.006,p=0.028)。BSZY、EV、RLX组肌肉组织SRC-3与PGC-1 α水平均高于OVX组,差异具有显著性(p均0.001)。而BSZY、EV、RLX三组间肌肉组织SRC-3与PGC-1 α水平的差别没有统计学意义(p=0.182)。2.4血清与肌肉、骨骼组织中SRC-3、PGC-1 α水平相关性血清SRC-3水平与肌肉、骨骼组织中SRC-3水平正相关,相关性具有统计学意义(p0.001)。肌肉组织中SRC-3水平与骨骼组织中SRC-3水平正相关,相关性具有统计学意义(p0.001)。血清PGC-1 α水平与肌肉、骨骼组织中PGC-1 α水平正相关,相关性具有统计学意义(p0.001)。肌肉组织中PGC-1 α水平与骨骼组织PGC-1 α水平正相关,相关性具有统计学意义(p0.001)。2.5各组大鼠肌肉组织中Wnt通路相关mRNA情况①PGC-1 a:与Sham组相比,OVX组PGC-1 α mRNA表达水平下降(p0.001),BSZY组相对于OVX组而言,PGC-1 α mRNA表达水平上升(p=0.001),EV、RLX组PGC-1 αmRNA 表达水平与 OVX 组无差异(p=0.259,p=0.314),且低于 BSZY 组(p0.05),BSZY组和 EV、RLX 组 PGC-1 α mRNA 表达水平均低于 Sham 组(p=0.006 和 p0.001);②ERR α:与Sham组相比,OVX组ERRα mRNA表达水平上升(p0.001),BSZY、EV、RLX 组均低于 OVX 组(p0.01),EV、RLX 组低于 BSZY 组(p0.001),EV、RLX组间比较没有差异(p0.05),BSZY、EV和RLX组均高于Sham组(p0.001);③SRC-3:与 Sham 组相比,OVX 组 SRC-3 mRNA 表达水平下降(p0.001),BSZY、EV 和 RLX 组均高于 0VX 组(p0.05),EV 和 RLX 组低于 BSZY 组(p0.05),BSZY、EV和RLX组均低于Sham组(均为p0.001);④OPN:Sham组、BSZY、EV和RLX组相对于OVX组而言,OPN mRNA表达水平下降(均为 P0.001),BSZY 组高于 Sham、EV 和 RLX 组(p0.05)),EV 和 RLX 组与Sham 组无差异(p=0.138,p=0.657);⑤OPG:Sham、BSZY、EV和RLX组相对于OVX组而言,OPG mRNA表达水平升高(均为p0.001),Sham 组高于 BSZY、EV 和 RLX 组(均为 p0.001),BSZY、EV 和RLX 组无差异(p0.05);⑥Runx2:与Sham组相比,OVX、BSZY、EV和RLX组Runx2 mRNA表达水平下降(p0.001),BSZY 组高于 OVX、EV 和 RLX 组(均为 p0.001),0VX 组与 EV 和 RLX组无差异(p0.05);⑦LRP5:与Sham组相比,OVX组、BSZY、EV和RLX组LRP5 mRNA表达水平下降(均为p0.001),BSZY 组高于 OVX、EV 和 RLX 组(p0.05),0VX 组与 EV、RLX 组无差异(p=0.145,p=0.257);⑧β-catenin:与 Sham 组相比,OVX、BSZY、EV 和 RLX 组 β-catenin mRNA 表达水平下降(均为p0.001),BSZY、EV和RLX组高于OVX组(p0.001),BSZY组高于 EV 和 RLX 组(p0.05)。2.6各组MAPK通路相关蛋白表达情况给药90天及180天后与Sham组相比,0VX组JNK、ERK1/2蛋白相对表达量均低,差异具有显著性(p0.001),各给药组与OVX组相比蛋白相对表达量均高,差异具有显著性(p0.001)。给药90天后,EV组、RLX组各蛋白水平与BSZY组比较,差异均无统计学意义(p=0.068)。给药180天后,EV组JNK蛋白表达水平高于BSZY组,差异具有显著性(p0.001),RLX组JNK、ERK1/2蛋白相对表达量均低于BSZY组,差异具有统计学意义(p=0.037)。两阶段EV与RLX组两种蛋白水平差异均无统计学意义(p==0.505)。结论1.本研究的临床部分证实了核受体辅助激活因子SRC-3和PGC-1 α可能参与绝经后骨质疏松中骨与肌肉代谢异常的病理过程。2.本研究的动物实验部分发现,在去卵巢骨质疏松大鼠模型中,血清SRC-3水平与肌肉、骨骼组织中SRC-3、PGC-1 α水平正相关,肌肉与骨骼组织中SRC-3、PGC-1α水平正相关。且根据药物干预,各部位两指标变化趋势相同,提示SRC-3、PGC-1α可能在骨与肌肉代谢水平调控中发挥一定作用且可能参与骨与肌肉之间的相互影响。且通过测定血清中的SRC-3、PGC-1 α水平即可一定程度上体现骨与肌肉组织中的SRC-3、PGC-1 α 水平。3.补肾健脾化瘀中药复方可能是通过提高骨与肌肉组织中SRC-3和PGC-1 α mRNA表达水平,降低ERR α及其下游基因OPN mRNA表达水平,促进成骨特异基因OPG、Runx2等表达,从而提高去势大鼠骨密度、骨强度、肌肉含量与肌力,MAPK通路可能亦参与该过程。
【图文】：

共激活,作用图,因子

－ｓＳＲＣ－３系ＥＲ与ＡＲ的共调节因子，属于ＳＲＣ家族，该家族系主要激素受体活性的核受体辅助因子。作为一类在结构和功能上都有白，该类因子通过直接或间接的方式与其它协同激活因子相互作核受体介导的转录激活。除ＡＣＴＲ外，ＳＲＣ家族还包括：①ＳＲＣ＿ｌ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１），邋ＳＲＣ－１在人体骨骼和肌肉形成中均物实验［１＇：显示，ＳＲＣ－１基因敲除小鼠的股骨近端松质骨（ｔｒａｂｅｃｕｌ照组相比受到严重影响，并伴随出现该部位的骨密度显著降低。于定向基因敲除动物模型的研宄发现，ＳＲＣ－１基因选择性敲除的促骨形成的作用产生了一定拮抗性。该研宄结果说明，在雌激素ＳＲＣ－１可能起着重要的作用。同－？研宄中ＳＲＣ－１基因选择性敲除形成异常等性状，推测可能与雄激素在雄性个体中对骨形成发挥。研究显示ＳＲＣ－１与骨骼肌细胞内ＵＣＰ３ｍＲＮＡ的表达有关，从而影化，并可促进脂肪代谢＂ｎ。②ＳＲＣ－２邋（ｓｔｅｒｏｉｄ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎ片分析数据显示ＳＲＣ－２同样涉及到雌激素受体对下游骨与肌肉的影响［１５］。逡逑

共激活,作用图,因子

ＡＣＴＲ／ＳＲＣ－３系ＥＲ与ＡＲ的共调节因子，属于ＳＲＣ家族，该家族系主要调控雌激素逡逑受体和雄激素受体活性的核受体辅助因子。作为一类在结构和功能上都有许多相似性逡逑的功能蛋白，该类因子通过直接或间接的方式与其它协同激活因子相互作用（图２），，逡逑从而增强核受体介导的转录激活。除ＡＣＴＲ外，ＳＲＣ家族还包括：①ＳＲＣ＿ｌ（ｓｔｅｒｏｉｄ逡逑ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１），邋ＳＲＣ－１在人体骨骼和肌肉形成中均起到重要的逡逑作用。动物实验［１＇：显示，ＳＲＣ－１基因敲除小鼠的股骨近端松质骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ邋ｂｏｎｅ）逡逑发育与对照组相比受到严重影响，并伴随出现该部位的骨密度显著降低。进一步深入逡逑进行的基于定向基因敲除动物模型的研宄发现，ＳＲＣ－１基因选择性敲除的雌性小鼠对逡逑雌激素的促骨形成的作用产生了一定拮抗性。该研宄结果说明，在雌激素对骨形成的逡逑调节中，ＳＲＣ－１可能起着重要的作用。同－？研宄中ＳＲＣ－１基因选择性敲除的雄性小鼠逡逑未发现骨形成异常等性状
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R259

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