艾烟提取物对原代培养神经元凋亡的影响及机制探讨

发布时间：2020-06-20 11:35

【摘要】：谷氨酸(Glutamate,GLU)是哺乳动物中枢神经系统主要的兴奋性神经递质,在许多神经生理过程中扮演着至关重要的角色,如神经元的生长发育、突触的稳定及可塑性、学习记忆和影响其他神经递质等。然而,谷氨酸在突触间的积累可引起神经元的毒性损伤、衰老及死亡,被称为神经元的“兴奋性毒性”。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑,Tau蛋白过度磷酸化形成的细胞内神经原纤维缠结,以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。谷氨酸介导的神经毒性损伤是阿尔茨海默病发生发展的重要机制之一。因此,如何有效的抑制谷氨酸引起的神经毒性细胞凋亡成为治疗AD的一条重要途径。艾烟提取物是从艾灸疗法艾烟中提取的有效混合物,含有多种生物活性成分,具有抗自由基、杀菌、抗凋亡、抗氧化应激等作用。关于艾灸机理研究的前期实验表明艾灸及艾烟的干预治疗通过抗氧化,调节神经营养因子和减少A β毒性等,能改善AD模型大鼠的学习记忆能力。这些实验结果提示艾烟及艾灸疗法可用于AD防治,艾烟提取物可能是一种治疗AD很有前途的药物。在此基础上,本实验应用艾烟提取物干预一日龄SD大鼠前额叶皮层和海马组织原代培养的正常神经细胞及谷氨酸诱导建立的神经毒性损伤细胞模型,观察其对正常细胞及损伤细胞模型的抗凋亡作用,并探讨艾烟提取物对正常神经细胞及谷氨酸介导的神经元毒性损伤模型的作用通路,以阐明艾烟提取物对正常神经细胞及AD细胞模型的保护作用及分子机制,为临床应用艾灸及艾烟提取物防治AD提供理论基础。目的:探讨艾烟提取物对前额叶皮层和海马神经元及谷氨酸介导的神经毒性损伤模型凋亡的影响及潜在机制。方法:采用24小时内新生SD大鼠乳鼠前额叶皮层及海马组织原代培养神经细胞,谷氨酸诱导建立神经毒性损伤病理模型。实验分两部分:1)检测不同浓度艾烟提取物对正常神经细胞凋亡的影响及机制研究,实验分组:空白对照组、艾烟提取物组、艾烟提取物+PI3K/AKT信号通路阻断剂组;2)检测艾烟提取物对神经毒性损伤细胞凋亡的影响及机制研究,实验分组:空白对照组、损伤模型组、艾烟提取物+损伤组、艾烟提取物+损伤+PI3K/AKT信号通路阻断剂组。运用MTT检测细胞存活率,TUNEL及DAPI免疫荧光检测细胞的形态学变化,以及Western Blot检测凋亡蛋白的表达。结果:(1)MTT和TUNEL检测显示谷氨酸能降低神经细胞的存活率和增加其凋亡率,并呈剂量依赖性(P0.001);0.1-1.0μg/mL艾烟提取物能够促进正常神经细胞的生长并减少其凋亡(P0.01-0.001);0.2-1.2μg/mL艾烟提取物能提高谷氨酸诱导的毒性损伤细胞模型存活率并抑制其凋亡(P0.01-0.001);(2)Western Blot检测显示谷氨酸能够降低抗凋亡蛋白P-Akt、Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白active-Caspase-3的表达(P0.01-0.001);艾烟提取物能够逆转正常神经细胞及谷氨酸诱导的P-Akt、Bcl-2表达下调和active-Caspase-3表达上调的现象(P0.01-0.001);PI3K/AKT通路阻断剂LY294002能够抑制艾烟提取物对神经细胞凋亡的挽救作用而降低P-Akt及Bcl-2表达并增加acti ve-Caspase-3表达(P0.05-0.001)。结论:一定浓度的艾烟提取物能促进细胞的生长并延缓神经细胞的凋亡,其机制可能通过激活PI3K/AKT信号通路并调控下游的细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、active-Caspase-3的表达来拮抗各种因素引起的神经细胞凋亡。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245
【图文】：

艾烟,提取物,神经细胞,自然生长

ｇ／ｍＬ）艾烟提取物组较对照组相比，能显著促进细胞的生长，延缓神经细胞自然凋逡逑亡，细胞存活率呈抛物线增高，表现出一定浓度药物依赖性（Ｐ＜0．邋０１－０．邋００１），但随着逡逑艾烟提取物浓度的升高，在１．０邋ｕｇ／ｍＬ以上出现药物毒性（见图１）。逡逑４８逡逑

保护作用,谷氨酸,毒性,有害物质

可能ＭＥ浓度太低，保护作用不明显。而ＭＥ大于１．２邋ｕｇ／ｍＬ以上没有发挥神逡逑经保护作用，显示出一定的药物浓度毒性，提示混合物中存在部分有害物质，需进一逡逑步纯化（见图１）。ＴＵＮＥＬ染色检测细胞凋亡结果进一步证实了邋ＭＥ对谷氨酸介导的神逡逑经毒性损伤的保护作用（见图２邋）。逡逑５８逡逑

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