基于MC活化-PAR2-CGRP环路探讨电针缓解PI-IBS模型大鼠内脏高敏感的作用机制

发布时间：2020-06-23 14:34

【摘要】：研究目的:IBS是常见的消化系统疾病,并且是针灸治疗的优势病种之一,但现有资料尚不能完全阐明其疗效机制。近来研究表明肥大细胞活化在IBS肠道异常的免疫-神经对话中发挥关键作用。肥大细胞活化后释放脱颗粒产物类胰蛋白酶(TPSP),裂解并激活肠神经元蛋白酶激活2型受体(PAR2),促进兴奋性神经递质CGRP、SP释放,而CGRP、SP可反作用于肥大细胞,加重其活化,从而诱发内脏高敏感。其中PAR2是上述信号相互作用、形成环路的重要桥接点。本课题通过观察电针对MC活化、PAR2及相关神经递质CGRP、SP的调节作用探讨电针治疗IBS内脏高敏感的机制。研究方法:以SD大鼠为研究对象,随机分为对照组(C)、模型组(M)、模型+电针组(M+EA)、模型+PAR2-AP组(M+PAR2-AP)、模型+PAR2-AP+电针组(M+PAR2-AP+EA)。采用TNBS建立PI-IBS内脏高敏感大鼠模型。造模完成后,AWR评分评估肠道敏感性。模型+电针组和模型+PAR2-AP+电针组(M+PAR2-AP+EA)取双侧足三里与天枢穴电针治疗2周。同期模型+PAR2-AP组(M+PAR2-AP)、模型+PAR2-AP+电针组(M+PAR2-AP+EA)行PAR2激动剂PAR2-AP灌肠操作,对照组不做特殊处理。疗程结束后,各组再行一次AWR评分评估肠道敏感性变化。取结肠组织及背根神经节,采用甲苯胺蓝染色法电镜下观察肥大细胞数目及形态改变;免疫蛋白质印迹法、实时荧光定量PCT法和免疫荧光法检测结肠和背根神经节处PAR2、CGRP、SP、TPSP蛋白及mRNA表达。研究结果:1.电针可缓解PI-IBS模型大鼠内脏高敏感,提升其疼痛阈值。腹壁撤离反射评分(AWR评分)示:与对照组相比,其他各组AWR评分均增加;与模型组相比,模型+电针组的AWR评分显著降低;与模型+PAR2-AP组相比,模型+PAR2-AP+电针组的AWR评分显著降低;与模型+电针组相比,模型+PAR2-AP+电针组的AWR评分有所增加。2.电针抑制肥大细胞活化及脱颗粒肥大细胞形态及脱颗粒标志物检测结果示:镜下观察可见对照组中MC形态规则,呈类圆形,胞膜完整,未脱颗粒;与对照组比较,模型组结肠组织MC形态不规则,细胞周围多片絮状物,呈脱颗粒状态;与模型组比较,模型+电针组MC形态规则,呈椭圆形,周围少有片絮状物,脱颗粒程度不明显;与模型+PAR2-AP组相比,模型+PAR2-AP+电针组形态较规则,呈椭圆形,周围少有片絮状物,脱颗粒程度不明显。类胰蛋白酶(TPSP)是肥大细胞脱颗粒重要标志物,其蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)、RT-PCR及免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结果显示:与对照组相比,模型组及模型+PAR2-AP组结肠组织TPSP的表达水平显著增高。与模型组相比,模型+电针组TPSP蛋白和mRNA的表达显著降低;与模型+PAR2-AP组相比,模型+PAR2-AP+电针组TPSP蛋白和mRNA表达显著降低;与模型+电针组相比,模型+PAR2-AP+电针组TPSP mRNA和蛋白表达显著升高。3.电针下调结肠PAR2、CGRP、SP表达WB、RT-PCR、IF检测结果示:与对照组相比,模型组和模型+PAR2-AP组PAR2蛋白及mRNA表达水平显著升高;与模型组相比,模型+电针组PAR2蛋白及mRNA表达水平显著降低;与模型+PAR2-AP组相比,模型+PAR2-AP+电针组PAR2蛋白的表达水平降低,但高于对照组和模型+电针组。与对照组相比,模型组CGRP、SP蛋白及mRNA表达水平显著升高,与模型组相比,模型+电针组CGRP、SP蛋白及mRNA表达显著降低;与模型+PAR2-AP组相比,模型+PAR2-AP+电针组CGRP、SP蛋白和mRNA表达水平显著降低。4.电针下调背根神经节PAR2、CGRP、SP表达WB、RT-PCR、IF检测结果示:与对照组相比,模型组和模型+PAR2-AP组PAR2、CGRP、SP蛋白及mRNA表达水平显著增高;与模型组相比,模型+电针组上述蛋白及mRNA表达水平显著降低;与模型+PAR2-AP组相比,模型+PAR2-AP+电针组上述蛋白及mRNA表达水平降低,但仍然高于对照组和模型+电针组。研究结论:本课题研究表明:1.TNBS灌肠所导致的PI-IBS病理条件下,大鼠内脏痛阈值显著降低,肥大细胞存在活化脱颗粒并兴奋邻近神经末梢,上调其PAR2的表达并促进神经递质CGRP和SP,诱导内脏高敏感。2.电针可显著提高PI-IBS模型大鼠内脏痛阈,抑制结肠MC活化,下调结肠组织和背根神经节中PAR2、TPSP、CGRP、SP蛋白及mRNA表达水平,促进内脏感觉传导通路恢复正常。3.在外源性应用PAR2激动剂的条件下,电针缓解内脏高敏感及对PAR2、TPSP、CGRP、SP等生物活性物质的下调效应减弱,反向证明电针通过调节PAR2的表达,对MC活化-PAR2-CGRP环路形成良性调控。综上所述:电针可通过下调PI-IBS大鼠结肠组织与背根神经节中MC活化-PAR2-SP/CGRP信号轴水平从而减轻内脏高敏感状态,其中PAR2是电针调节MC活化-PAR2-CGRP环路的重要靶点。电针足三里、天枢穴可健脾补虚、理气止痛,调节免疫-神经对话是其潜在的重要机理,本文初步阐明电针调控PAR2介导的免疫-神经交互作用为其治疗内脏痛的机制之一,但因内脏痛发生机制的复杂性,尚需深入研究以详细阐明。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245.97;R-332
【图文】：

模型＋电针组ＭＣ形态规则，呈楠圆形，周围少有片絮状物，脱颗粒程度不明显；逡逑与模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ组相比，模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ＋电针组形态较规则，呈椭圆形，周围少有片絮逡逑状物，脱颗粒程度不明显。见图２。结果表明，ＰＩ－ＩＢＳ大鼠结肠粘膜中ＭＣ的活化脱颗粒逡逑程度明显，电针可降低结肠粘膜中ＭＣ的活化脱颗粒程度。逡逑Ｉ匿，组Ｂ邋＇逦嫇Ｃ邋；逡逑．岤逡逑图２各组大鼠结肠黏膜ＭＣ电镜下细胞形态比较逡逑注：各组结肠粘膜ＭＣ细胞形态在电镜卜＿观察，放大倍数１５０００，标尺２ｐｍ；各组箭头所指为ＭＣ脱颗逡逑粒片絮状物逡逑３６逡逑

逑２．２肥大细胞脱颗粒标志物ＴＰＳＰ逡逑与对照组相比，模型组ＴＰＳＰ的表达水平显著增高，见图３Ａ。与模型组相比，模型＋逡逑电针组ＴＰＳＰ邋ｍＲＮＡ和蛋白的表达显著降低；与模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ组相比，模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ＋逡逑电针组ＴＰＳＰ邋ｍＲＮＡ和蛋白表达显著降低，但高于模型＋电针组，见图３Ｂ、图３Ｃ、图３Ｄ。逡逑表明ＰＩ－ＩＢＳ大鼠ＴＰＳＰ邋ｍＲＮＡ和蛋白表达水平较高，电针可降低ＴＰＳＰ的表达。逡逑上述肥大细胞形体学观察及脱颗粒标志物检测结果表明电针具有稳定肥大细胞的作逡逑用，且这种作用可被ＰＡＲ２激动剂部分拮抗，提示ＰＡＲ２激动剂诱导的神经兴奋作用可反逡逑作用于肥大细胞。逡逑ｐ＜Ｏ．ＯＩ逡逑Ａ逦ＴＰＳＰ逦ＤＡＰＩ逦Ｍｅｒｇｅ逦Ｂ邋．邋２0逦｜逦１逡逑卜邋｜逡逑ＭＭＭ逡逑ｍ＋ａｐ逦＼ｉ＋ａｐ＋ｆ．ａ邋ｍ＋ｅａ逡逑、逦：：a蓮I逦丨？？？鲁一丨－逡逑ｖ，邋１邋ｖ邋逦逡逑Ｈ邋１＾１邋Ｈ９邋ｍｍｍｍｗｍ］—逡逑Ｍｍ逦ｔ逡逑■■■ｈｉ逦＇ｒｎｌｎＩＩ逡逑~柌蜅H邋ｇ？．？ｉｉ邋＿邋ｉ邋攀邋ｉ．邋ｉ邋＿■攀逡逑图３各组大鼠结肠组织中ＴＰＳＰ免疫荧光显微镜、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ、ＲＴ－ＰＣＲ结果比较逡逑注：图Ａ：各组大鼠结肠组织免疫荧光图像，用抗ＴＰＳＰ（绿色）染色，标尺ｌ0ｎｍ。图Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ检测逡逑ＰＡＲ２邋ｍＲＮＡ表达，内参为ＧＡＰＤＨ。图Ｃ：结肠组织中ＴＰＳＰ表达的蛋白质印迹。图Ｄ：通过蚩白质逡逑印迹测定ＰＡＲ２表达的定Ｍ

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本文编号：2727470