苗药防感香囊通过TLR-MyD88-NFκB通路上调呼吸道免疫力的机制研究

发布时间：2020-07-12 22:11

【摘要】：目的:以MyD88基因敲除小鼠和人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)为模型,阐明苗药防感香囊(香囊)通过TLR-MyD88-NFκB通路提高呼吸道免疫力的机理。方法:1.体内研究:背景系为C57BL/6J雄性小鼠16只,SPF级,随机分为2组,每组8只:空白对照组(control组),香囊组(MFS组);MyD88基因敲除小鼠16只(购自南京大学实验动物中心),雄性,SPF级,随机分为2组,每组8只:MyD88基因敲除组(MyD88-KO组),MyD88基因敲除+香囊组(MyD88-KO+MFS组)。香囊干预组小鼠持续予以苗药防感香囊吸入处理30天(8:00am-8:00pm持续12小时吸入香囊,6天更换1次),30天后处死小鼠取材,检测血常规、肝肾功能等常规生化指标;采用hematoxylin-eosin染色观察各组小鼠肺组织病理形态变化;采用免疫组织化学、免疫荧光技术、Western Blot方法、qRT-PCR等方法检测小鼠肺组织TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的表达。2.体外研究:苗药防感香囊提取物由苗药防感香囊课题组前期试验提供,BEAS-2B细胞购自中国科学院昆明细胞库,CCK8法探索苗药防感香囊提取物作用于BEAS-2B细胞的最适浓度及时间。实验分为6组:空白对照组(Control组)、MyD88 siRNA组(MyD88 siRNA,MyD88 SI组)、MyD88 siRNA-阴性对照组(MyD88 siRNA negative control,MyD88 SI-NC组)、香囊刺激组(Sachet组)、MyD88 siRNA+香囊刺激组(MyD88 SI+Sachet组)、MyD88 siRNA-阴性对照+香囊刺激组(MyD88 SI-NC+Sachet组)。Western Blot、qRT-PCR等方法检测各组BEAS-2B细胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的表达。结果:1.体内研究:(1)病理结果显示:空白对照组、香囊组、MyD88基因敲除组、MyD88基因敲除+香囊组小鼠肺组织轮廓完整,器官、支气管、毛细血管结构清晰、肺泡壁无明显渗出。香囊组小鼠部分标本肺泡腔内可见少量单核细胞、中性粒细胞浸润,Mikawa肺损伤评分进行统计,与空白对照组、香囊组相比,结果无统计学差异。(2)血常规:香囊组小鼠白细胞水平升高(P0.05)。生化指标:各组小鼠肝肾功统计结果无统计学差异(P0.05)。(3)TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的基因和蛋白表达情况:免疫组化、RT-PCR、Western Blot检测结果提示,与空白对照组相比,香囊组(MFS组)小鼠肺组织上述分子的基因和蛋白表达水平升高(P0.05);MyD88-KO组、MyD88-KO+MFS组小鼠肺组织上述分子的基因和蛋白表达水平减低(P0.05);与MyD88-KO组相比,MyD88-KO+MFS组小鼠肺组织的表达水平稍升高(P0.05)。2.体外研究:(1)苗药香囊提取物浓度为0.003125g/ml时不影响BEAS-2B细胞的细胞活力,且TAK1、NFκB p65、IκB、MyD88的mRNA的表达量最高(P0.05)。(2)与空白对照组相比,MyD88 siRNA组、MyD88 siRNA组+香囊刺激组中BEAS-2B细胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6基因和蛋白的表达显著下降(P0.05),香囊刺激组、MyD88 siRNA-阴性对照+香囊刺激组中BEAS-2B细胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的表达显著升高(P0.05);与MyD88 siRNA组相比,MyD88 siRNA组+香囊刺激组中BEAS-2B细胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6基因和蛋白的表达稍增加(P0.05)。结论:苗药防感香囊能够提高机体呼吸道免疫力,MyD88可能为香囊调节呼吸道免疫力的关键因子,香囊可通过增强MyD88表达,激活TLR-MyD88-NFκB信号通路,并刺激下游细胞因子的释放起到免疫调节的作用。此外,苗药防感香囊也可能通过MyD88信号传导通路以外的其它途径刺激下游细胞因子的表达,起到调节呼吸道免疫力的作用。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R29
【图文】：

动物来源背景系 C57BL/6J 的普通小鼠及 MyD88 基因敲除（MyD88-KO）小鼠各，雄性，SPF 级， 6-7 周鼠龄，体重 25-35g，购自南京大学实验动物中附有 MyD88 的基因检测报告（见图 1-1）。标准饲料购自贵州医科大学动心。

图 1-2 标准品梯度稀释标准曲线ig. 1-2 Standard curve of gradient dilution for standard substa品梯度稀释标准曲线（图 1-2）计算出待测样品的浓度，样本浓度。

图 1-3 小鼠肺组织解剖图Fig. 1-3 Anatomical map of lung tissue in miceControl 组 MFS 组 MyD88-KO 组 MyD88-KO+MFS 组

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本文编号：2752553