基于μ阿片类受体（OPRM1）及其剪切异构体研究电针和多甲氧基黄酮镇痛机制

发布时间：2020-07-15 22:59

【摘要】：背景/目的近几十年来,大量临床调查和实验研究都论证了电针和中药广泛地应用于各种损伤和疾病引起的疼痛的治疗。有大量的研究结果显示,电针可以产生内源性的阿片肽,某些炎症虽然参与了电针镇痛,但是认为外周和中枢阿片受体是其发挥作用的主要靶点,并且以吗啡为代表的μ阿片类药物可引起大脑不同区域μ阿片类受体及其剪切异构体的改变。本实验采用了野生型C57BL/6小鼠(WT)及同品系μ阿片类受体基因敲除小鼠(mE7b),专注于研究中枢神经系统特定区域的μ阿片类受体及其剪切异构体,尝试寻找电针及中药与OPRM1的联系,旨在探索电针和中药镇痛的效力和机制。方法电针治疗疼痛的方案很多,通过对此类文献的统计分析,确定选穴以及具体的实验操作细节,比如不锈钢针的规格、电针仪的频率、针刺的深度、电流的强度及刺激的时间等等;同时,传统中药材中具有镇痛效应的很多,包括元胡(延胡索)、白芷、蟾酥等等,根据作用机制的不同,本研究选取了主要作用于μ阿片类受体的多甲氧基黄酮类(提取于柑橘属的药材)药物来进行实验。首先,我们建立了小鼠的疼痛模型,在模型建立成功后,予以电针刺激及药物治疗,检测其疼痛行为学的改变,记录并分析数据,观察同样条件下WT和mE7b小鼠之间的差异;其次,通过qPCR观察电针及药物对于小鼠不同脑部区域μ阿片类受体基因的mRNA表达的影响;在确定了电针及药物是通过阿片类受体发挥作用后,对WT小鼠进行局部(外周)或脑室(中枢)注射β-FNA,一种μ阿片类受体拮抗剂,随后再予以电针刺激和药物治疗,比较外周和中枢使用β-FNA的行为学差异,探索电针和中药镇痛的主要靶点;最后再通过Western Blot和免疫组化技术分析应用电针和中药治疗后疼痛的下游分子指标ERK1/2和c-Fos的变化。结果1.电针和多甲氧基黄酮可以改善福尔马林诱导的急性疼痛,尤其是第二相痛,同时也可改善CFA诱导的疼痛模型鼠在24h内对热刺激和机械刺激的反应;2.在脑室注射了β-FNA后,电针的镇痛效果显著降低,而局部注射β-FNA则影响不大,仅在4h这个时间点镇痛效果出现降低;与此不同的是,脑室注射β-FNA可显著降低多甲氧基黄酮的镇痛效果,而局部注射β-FNA则对多甲氧基黄酮的镇痛效果完全无影响;3.电针和多甲氧基黄酮可调控疼痛相关脑区OPRM1的表达,尤其是电针更显著;4.CFA诱导的疼痛模型鼠脑部区域p-ERK的表达显著上调,电针治疗可以使WT小鼠ERK的磷酸化水平降低,接近正常水平;对于mE7b小鼠,电针降低了THA区域的磷酸化水平而对RVM区域无影响;与此同时,CFA诱导的疼痛模型鼠脑部区域c-Fos的表达也显著上升,在WT小鼠,电针治疗可降低这一效果,除了THA区域,而对于mE7b小鼠,电针仅可降低RVM区域c-Fos的表达;5.与电针不同,多甲氧基黄酮虽能降低WT小鼠ERK的磷酸化水平,但是并不能降低mE7b小鼠ERK的磷酸化水平;与此同时,多甲氧基黄酮也不能降低mE7b小鼠脑部区域c-Fos的表达。结论1.电针和多甲氧基黄酮均可降低福尔马林诱导的二相痛和CFA诱导的持续性疼痛,而在μ-opioid受体基因敲除后,镇痛作用都有所下降,在多甲氧基黄酮治疗组这一效应更明显;2.电针主要通过中枢μ阿片类受体发挥作用而多甲氧基黄酮则完全通过中枢μ阿片类受体发挥作用;3.已知电针可以通过产生内源性阿片肽发挥作用,我们的结果表明,电针对于OPRM1基因及其剪切异构体mRNA表达水平的调节也参与了电针的镇痛过程,而多甲氧基黄酮则是作为一种阿片类药物发挥镇痛作用,对OPRM1并无影响;4.ERK的磷酸化水平和c-Fos的表达水平在CFA诱导的疼痛模型鼠的脑部区域中显著上调,说明这两个指标的上调能代表小鼠处于疼痛状态,而电针和多甲氧基黄酮对于p-ERK和c-Fos的下调可出现在大多数WT小鼠的脑部区域,而对于mE7b小鼠则无此效果,说明电针和多甲氧基黄酮可通过降低ERK的磷酸化水平和c-Fos的表达水平来发挥镇痛作用,这一过程需要μ-opioid的参与。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245
【图文】：

逑使用的还是Ｍ阿片类受体。逡逑图１－３显示了阿片受体家族的分类。逡逑Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｈｃ邋ｏｐｉｏｉｄ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｆａｍｉｌｉｅｓ逡逑Ｒｅｃｅｐｔｏｒ逦Ｄｒｕｇｓ逦Ａｎａｌｇｅｓｉａ邋Ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ邋Ｄｙｓｐｈｏｒｉａ邋Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ）邋Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ逦Ｃｉｅｎｃ逡逑Ｍｕ逦Ｍｏｒｐｈｉｎｅ逦Ｙｅｓ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦Ｙｅｓ逦ＭＯＲ－１逡逑Ｋａｐｐａ邋Ｋａｐｐａ邋｜邋Ｄｖｎｏｒｐｈｉｎ邋Ａ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦ＫＯＲ－ｌ逡逑Ｕ５０．４８８Ｈ逡逑Ｋａｐｐａ＾逦Ｅｔｈｙｌｋｅｔｏｃｙｃｌａ／ｉＫｉｎｃ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦ＫＯＲ－ｌ邋ＤＯＲ－１逡逑Ｋａｐｐａ；逦Ｎａｌｏｘｏｎｅ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦Ｎｏ逦Ｎｏ逦Ｓｅｅ邋ｂｅｌｏｗ逡逑Ｂｅｎｚｏｙｌｈｙｄｒａ／ｏｎｅ逡逑Ｉ．ｃｖｏｒｐｈａｎｏｌ逡逑Ｄｅｌｔａ逦ｔｎｋｅｐｈａｌｉｎ逦Ｙｅｓ逦Ｎｏ逦？逦Ｎｏ逦ＩＫ）Ｒ－Ｉ逡逑ＤＰＤＰＥ逡逑图１－３阿片受休家族的分类逡逑第一个猜想大约在二十世纪七十年代（１９７５年）被提出来，即卩阿片类受体不止一逡逑个家族，这大约是ｐｉ、｜ｎ２被提及后最有说服力的？个分类（提出者为Ｇａｖｒｉｌ邋Ｗ．邋Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，逡逑为美国纪念斯隆凯特林癌症中心阿片受休领域最具影响力的人物，于２０１９年年初在美国逡逑逝世，谨以词句纪念ＧＷ在阿片领域做出的巨大贡献和表达本实验室能够与斯隆进行课逡逑题合作的幸运之意）１｜５４１。该观点指出尽管阿片类药物譬如吗啡与其有高度的亲和力，确逡逑定其为阿片类受体

逦ｊｆｉ；逡逑ｈＭＯＲ邋ＩＫ逡逑图１－５和图１－６显示了对于不同品系和性别小鼠脑部冈域ＭＯＲｓ表达量的研究。逡逑■邋ＳＷＲ．Ｗ８逡逑１Ｗ逡逑ＳＷ？邋ＰＡＧ逡逑Ｂ？邋Ｈｙｐ逡逑６６邋ＢＳ逡逑ＳＷＲ邋Ｔｈ？逡逑ＳＷＲ邋Ｓｋ逡逑ＳＡ逡逑ＳＡ邋Ｔｈ？逡逑１２９邋ＢＳ逡逑ＳＯＬ邋ＰＡＧ逡逑１２９邋Ｐ４０逡逑Ｂ６邋Ｓｐｃ逡逑１２？邋Ｓ0ｔ逡逑１２９邋ＷＢ逡逑８６邋Ｓｉｒ逡逑ｆ？邋ｈ＊逡逑１？邋？ｃ逡逑ＳＪＬ邋ＷＢ逡逑ｓｗ？＿ｃｔ＞逡逑ＳＷＲ邋Ｐｆｃ逡逑ＳＪＬＳｈ逡逑ａｅ邋ｔｖｓ逡逑ＳＷＲ邋Ｈ？）逡逑ＳＪｌ邋ＢＳ逡逑认？逡逑ＳＪｌ邋Ｓｅｃ逡逑ＳＷ？邋ＢＳ逡逑Ｂ６邋Ｔｈａ逡逑ｉｎ邋Ｔｈ？逡逑１２９邋Ｓｆｔ逡逑ＳＷＨ邋Ｍｙｐ逡逑５ＷＨ邋８ｐｃ逡逑Ｍ邋Ｍ0逡逑＆Ａ邋Ｃｂ逡逑ＳＪｌ邋Ｐｆｃ逡逑ｌ？邋Ｃｂ逡逑Ｂ０邋Ｃ？逡逑Ｂ６邋Ｐｆｃ逡逑￣５５５２？Ｓ＾２Ｓ＾ｉｆ＾＾＜？？ｔ：ｌ５＾Ｓ？ａ＾ｅ２５？＾逡逑￥＂邋＂邋＂邋＂邋＂邋ｉ邋ｈ邋ｉ＂邋＂邋ｉ邋ｎ邋ｍ邋ｍ！逡逑Ｚ－Ｓｃ0ｒｅ逡逑图１邋－５四种品系鼠ＭＯＲｓ的表达逡逑２３逡逑

图２－１电针对于福尔马林诱导的ＷＴ和ｍＥ７ｂ小鼠二相痛的影响逡逑３．２电针对？热盘实验中完全弗氏佐剂（ＣＦＡ）诱导的疼痛模型的影响逡逑ＣＦＡ足底注射诱导的疼痛稳定持续约？周至两周左右，起效时间在注射后４小时，福尔马林诱导的二相痛和间歇期不同，造模之后产生疼痛且对热刺激产生较稳定的痛敏，因此我们利用热盘实验观察了电针刺激后２４小时内的治疗效果。由于预实验表ＷＴ和ｍＥ７ｂ小鼠在足底注射ＣＦＡ后对热刺激的反应没有差异，我们用ｂａｓｅｌｉｎｅ代表和ｍＥ７ｂ小鼠在造模之后对热刺激的阈值（约为１５．７ｓ左右出现抬腿或者舔足等疼痛反应）。统计结果如下：逡逑电针治疗后２小时，在ＷＴ和ｍＥ７ｂ小鼠均能产生镇痛效果，且两者的治疗效果在统计学差异，平均ＭＰＥ值分别为２４．８２３％邋（ｍＥ７ｂ＋ＥＡ）和２６．２１５％邋（ＷＴ＋ＥＡ）；逡逑电针治疗后４小时，ＷＴ＋ＥＡ组表现出更为明显的镇痛效果，ＭＰＥ＝４２．７０８±８．３９８为所有数据中治疗效果最佳的ｔｉｍｉｎｇ点，与ｂａｓｅｌｉｎｅ相比，Ｐ＜０．０１，＊＊，ｆｆｔｉ在ｍＥ７ｂ＋组，ＭＰＥ＝１８．０８５±４．７８％，虽然与ｂａｓｅｌｉｎｅ相比仍然具有镇痛效果，侃是４ＷＴ＋ＥＡ组，Ｐ＜0．0５，邋＃

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本文编号：2757129