膝骨关节炎模型大鼠腧穴敏化不同时间节点的肥大细胞机制研究

发布时间：2020-07-26 20:44

【摘要】：研究目的本研究旨在深入探讨膝骨关节炎模型大鼠腧穴敏化不同时间节点穴区局部肥大细胞(MC)形态和功能变化的时空特征,初步阐明穴位敏化中MC的细胞分子水平的机制,为针灸临床治疗膝骨关节炎提供客观的实验支撑,进一步丰富穴位敏化MC相关的机制研究,解释穴位敏化细胞分子层面的科学内涵。研究方法SD雄性大鼠120只,随机分为正常(N)组、生理盐水(NS)组、模型(KOA)组三组,每组40只。然后每组按照0、7、14、21、28天五个时间节点随机再分为五组,每组8只。适应性饲养后造模,KOA组采用单碘乙酸盐(MIA)诱导膝骨关节炎模型,大鼠麻醉后,清理关节附近的鼠毛,将关节屈曲到最大限度后向双侧的膝关节腔内注射MIA 3mg/50 L 9%生理盐水,NS组用同样的方法于双侧膝关节腔内注入50 L 9%的生理盐水,N组则不做处理。三组仅饲养,均不做任何干预处理。N组、NS组及KOA组分别在实验开始的第7天随机处死6只动物并取动物的左侧膝关节,采用番红固绿染色对关节软骨进行染色,观察关节软骨的形态,并对关节软骨进行OA评分。N组、NS组及KOA组分别在实验开始的第0、7、14、21、28天随机处死6只动物,分别以右侧鹤顶穴、阳陵泉穴、委中穴为中心取1.5mm×1.5 mm×1.5 mm体积大小的标本(包含皮肤及皮下结缔组织),采用甲苯胺蓝染色技术观察MC形态和功能的变化,每张切片手动随机选取6个不重复视野,分析并记录MC的数目和脱颗粒变化,计算脱颗粒率。N组、NS组及KOA组分别在实验开始的第0、7、14、21、28天随机选取2只小鼠灌流取穴区组织,采用免疫荧光(IF)染色技术观察不同时间节点鹤顶穴、阳陵泉穴、委中穴穴区组织内肥大细胞类胰蛋白酶(MCT)与5-羟色胺(5-HT)、组织胺(HA)共表达情况。研究结果1.番红固绿染色结果显示,N组和NS组的关节软骨表面光滑连续、无损伤,而KOA组关节软骨的形态学出现明显的改变,关节软骨表面不连续,基质损伤或者缺失、断裂、剥夺,甚则软骨组织被侵蚀,关节表面轮廓发生典型的病理改变。KOA组关节软骨的OA评分显著高于N组、NS组(P0.05)。2.甲苯胺蓝染色结果显示,三穴在N组及NS组不同时间节点MC的数量和脱颗粒率无统计学差异(P0.05);KOA组鹤顶穴及阳陵泉穴在相同时间节点上MC的数量和脱颗粒率显著高于N组和NS组(P0.05);KOA组内比较结果显示鹤顶穴及阳陵泉穴自第7天至28天MC的数量及脱颗粒率均高于0天,在不同时间节点上穴区MC数量及脱颗粒率比较有显著差异(P0.05)。3.IF染色结果显示,KOA组鹤顶穴及阳陵泉穴MCT与5-HT、HA存在共表达现象,而委中穴没有或者较少出现共表达情况;N组及NS组未出现上述共表达现象。结论1.关节腔注射MIA能够造成关节软骨明显的病理变化,这种方法能成功诱导出膝骨关节炎模型。2.穴位敏化中穴区MC发生了典型的募集和脱颗粒变化,其中鹤顶穴和阳陵泉穴在不同时间节点穴区MC有时空变化的特征;穴位敏化是一个动态变化的过程,从某一时间点开始敏化并持续一段时间;穴位敏化有时空变化的特征。3.穴位敏化中MC脱颗粒释放的递质有5-HT、HA,这两种物质在敏化的不同时间节点有不同的表达,穴位敏化中MC与5-HT,HA变化的机制可能是5-HT,HA以及MCT的释放直接影响患病的受影响的穴位处的循环,神经和免疫网络,在穴位敏化中起到触发效应。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245;R-332
【图文】：

膝骨关节炎模型大鼠腧穴敏化不同时间节点的肥大细胞机制研究４６分布或方差不齐，采用非参数检验，用2个独立样本进行两两比较。当P<0.05时，认为具有显著性差异。5实验结果5.1各组大鼠膝关节软骨切片的OA定量评分结果KOA组较N组和NS组均有明显的差异，KOA组的OA评分显著高于N组和NS组(P<0.05)（见图1）。图1：各组OA定量评分注：与N组相比较，P<0.05；与NS组相比，P<0.05。5.2各组膝关节软骨番红固绿染色结果番红固绿染色结果显示N组及NS组关节软骨表面光滑、完整，看不到损伤，而KOA组则出现关节软骨表面断裂，纤维化严重，甚则分层，基质缺失，损伤程度大于50%（见图2）。ABC图2：关节软骨番红固绿染色

膝骨关节炎模型大鼠腧穴敏化不同时间节点的肥大细胞机制研究５４图5第14天MC甲苯胺蓝染色6小结甲苯胺蓝（ToluidineBlueO）是一种常用的人工合成染料，其中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子结合而被染色，细胞核被染成蓝色，MC内的HA等异染质呈异染性紫红色。MC与穴位有密切的关系，MC是穴位重要的组织形态学依据，也是穴位功能的重要载体，目前关于腧穴敏化的研究大多聚焦于MC上，DingN[17]等发现随着疾病程度的加

膝骨关节炎模型大鼠腧穴敏化不同时间节点的肥大细胞机制研究６１图1:MCT与5-HT共表达情况。注：N组与KOA组IF染色结果，绿色标记的为MCT，红色标记的为5-HT，蓝色标记的为细胞核，红色箭头代表MC脱出的类胰蛋白酶，白色箭头代表MCT与5-HT共表达情况。

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本文编号：2771265