基于UPLC-MS技术初探AECOPD痰热壅肺证代谢模式特征

发布时间：2020-07-28 12:01

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)在呼吸系统疾病中较为常见。我国是COPD的高发地区,40岁以上成年人患病率高达9.9%。慢性阻塞性肺疾病急性加重期(Acute exacerbationchronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)是目前国内最常见的致死性呼吸系统疾病之一,多因受到感染诱发,表现为咳嗽、咳痰、喘息等呼吸道症状突然加重,严重时可危及生命。西医治疗该病以抗感染药物和对症支持治疗为主,疗效较为稳定,但长期使用吸入类激素药物可能导致肺部感染风险增高,同时存在骨质疏松及免疫抑制等不良反应,限制了其临床使用。本课题组长期致力于COPD的基础与临床研究,目前对COPD的致病机理、病因病机、证候要素和中医治疗有了系统而深入的研究,但对于该病证型的证候本质的认识尚浅显。本课题与北京中医药大学中药学院高晓燕教授课题组合作,具备较为完善的代谢组学分析平台。因此,本课题采用代谢组学这一现代新生物科学研究技术,结合临床肺功能、血常规检查及症状评估等结果,对AECOPD最常见的痰热壅肺证进行证候物质基础研究。研究目的:一方面,采用超高效液相色谱质谱联用技术(Ultra Performance Liquid chromatography-mass spectrometer,UPLC-MS)技术,研究AECOPD痰热壅肺证患者血清样本的代谢产物,探求AECOPD痰热壅肺证的证候物质基础;另一方面,进行中医证候学代谢通路研究,初探AECOPD痰热壅肺证和非痰热壅肺证的代谢模式,期望建立一种可用于临床的中医宏观与西医微观相结合、中医证候观察与西医检查指标相结合的证候分型方法,为AECOPD中医辨证论治提供有效靶点。研究方法:选取北京地区慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者46例(痰热壅肺证26例,非痰热壅肺证20例),身体健康的志愿者10例,获得受试者知情同意后,收集空腹外周静脉血2ml,室温静置,离心取上层血清,-80℃冰箱储存,进行超高效液相色谱-质谱联用分析,利用主成分分析、多维分析和单维分析相结合的办法,筛选组间差异代谢物(VIP2,p0.05)。通过METLIN、KEGG、LIPID MAPS 和Chemspider筛选化合物结构,代入MetPA进行差异代谢物通路分析,通过组间比较,探究AECOPD痰热壅肺证的证候物质基础。研究结果:慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者与健康对照组相比较,共发现53种小分子差异代谢物,主要涉及花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢等9条相关代谢通路;急性加重期痰热壅肺证组与非痰热壅肺证组相比,共发现50种小分子差异代谢物,主要涉及鞘脂类代谢、甘油磷脂代谢、亚油酸代谢代谢等7条相关代谢通路。结论:1、UPLC-MS技术能够的较好区分AECOPD与健康人血清的代谢模式,慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者的血清较健康人相比可见多种磷脂、脂肪酸、氨基酸等人体三大能量物质的含量发生变化,主要存在花生四烯酸、甘油磷脂代谢等代谢通路受到扰动。2、AECOPD不同证型之间存在小分子代谢物与代谢通路差异,AECOPD痰热壅肺证患者血清中主要存在鞘脂类代谢、甘油磷脂代谢等通路紊乱。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R259
【图文】：

逑５．邋２分析流程图逡逑本课题有关代谢组分析实验流程如图２所示：（委托北京中医药大学中药学院）逡逑ｕ样品懫集所＾处理逡逑代谢物提取逡逑ＧＣ－ＭＳ逦ＬＣ－ＭＳ逦ＮＭＲ逡逑－逦＊邋■邋—邋Ｚ逡逑…卜０＂＊：逦：逦数据懫集与倌患识别逡逑丨．＊邋＿邋．邋Ｉ丨：■、，■？逡逑＾＾＾逦４，逦＾逡逑ＰＣＡ分析逦ＰＬＳ－ＤＡ分析逦Ｃｌｕｓｔｅ汾析逦Ｐａｔｈｗａｙ＾、析逦深度分析逡逑图２代谢组学分析流程逡逑１．５．３试验仪器和试剂逡逑１．邋５．邋３．邋１邋仪器逡逑Ｗａｔｅｒｓ邋Ａｃｑｕｉｔｙ？快速高分辨液相色谱飞行时间联用仪ＯＪＰＬＣ）邋；邋Ｘｅｖｏ？邋Ｇ２邋Ｑ／Ｔ０Ｆ逡逑串联四极杆飞行时间质谱系统；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ邋Ｓｙｎｅｒｇｙ邋ＵＶ型超纯水机；Ｄ－３７５２０邋Ｏｓｔｅｒｏｄｅ逡逑高速冷冻离心机（德国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）；ＭＴＸ－３０００型多管祸旋振荡器（杭州米欧逡逑仪器有限公司）逡逑１．５．逦３．邋２邋试剂逡逑甲醇（ＬＣ／ＭＳ级，Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｆｉｓｈｅｒ公司）；超纯水由Ｖｌｉ丨１邋ｉｐｏｒｅ邋Ｓｙｎｅｒｇｙ邋ＵＶ型超纯逡逑水机制备；甲酸（丨；Ｃ／ＭＳ级，Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｆｉｓｈｅｒ公司）逡逑１．５．４样品前处理逡逑血清样品于４°Ｃ室温解冻，取解冻后血清样本１５０叱，加入４５０虬甲醇沉淀蛋白，逡逑涡旋振荡３０ｓ，静置１０邋ｍｉｎ，经１２０００邋ｒｐｍ，４°Ｃ，离心１０邋ｍｉｎ后，样本分层，底部沉逡逑淀。取４００逦上层清液，经氮气吹干后，加入ｌ00Ｗ．超纯水进行复溶，涡旋３０邋ｓ，静逡逑置１０ｍｉｎ

正离子模式血清样本的基峰离子流图

负离子模式血清样本的基峰离子流图

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本文编号：2772853