壮药苏铁抑制NSCLC生长的活性成分及作用机制研究

发布时间：2020-08-10 20:02

【摘要】：目的:肺癌是全球范围内癌症相关死亡的主要原因,肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中,非小细胞肺癌约占所有肺癌病例数的85%。由于肺癌细胞生长迅速,早期转移和对放、化疗的抵抗,导致NSCLC的5年生存率仍然约为15%。NSCLC通过激活多种主要的信号通路导致癌细胞的存活以及化学抗性,而细胞凋亡和自噬是控制细胞存活和细胞死亡的两种重要的生理活动,在NSCLC的病理生理学中起着至关重要的作用,自噬与凋亡之间的相互作用影响着细胞的稳态、死亡细胞的清除以及临床治疗。近年来,中医药及其有效成分的抗癌研究成为肿瘤学研究的热点。苏铁(Cycas revoluta Thunb)是苏铁科苏铁属常绿棕桐状木本植物,具有观赏、药用和食用价值,其主要成分为黄酮类化合物,氨基酸和糖类等,具有清热、止血、散瘀的功效。本课题首先对苏铁进行生药学的鉴定,明确苏铁的鉴别方法。同时,对苏铁总黄酮进行体内实验研究,探讨苏铁总黄酮抗肺癌的初步作用。为了明确苏铁抗肺癌的活性成分及作用机制,对苏铁的化学成分进行系统的分离和鉴定,然后结合查阅文献和活性筛选实验的结果,确定苏铁双黄酮为实验的研究对象,进一步采用体外实验从凋亡和自噬的角度探讨苏铁双黄酮抗肺癌生长及转移的分子机制,明确其主要作用途径和作用靶点。方法:(1)采用原植物形态鉴别、性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别的方法对苏铁叶生药学特征进行鉴定。(2)选取造模成功的Lewis肺癌荷瘤小鼠84只,随机分为模型组、空白对照组、苏铁总黄酮高、中、低剂量组、顺铂给药组、联合用药组,每组12只。分别给药干预14天,于第15天时摘眼球法取血,常规法剥取Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤组织、肺、脾、胸腺,并分别称重,计算抑瘤率;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测Lewis肺癌荷瘤小鼠血清中白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的含量;采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的病理形态变化;采用免疫组化法和Western blot法检测Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF、bFGF、HIF-lα和NF-κB蛋白的表达水平;采用实时荧光定量PCR法检测Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF、bFGF、HIF-1α 和-κB mRNA 的表达水平。(3)取苏铁叶15kg,粉碎成粗粉后用75%乙醇浸泡1 h,之后回流提取(3Xl00LX1.5h),45℃水浴减压浓缩得总提物稠膏1.3Kg。总提物经适量水溶解后,分别用二氯甲烷、正丁醇萃取,得到二氯甲烷萃取物200 g和正丁醇萃取物375 g。然后利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20、HPLC等分离手段对二氯甲烷萃取物进行分离纯化,并通过核磁波谱、文献数据等手段进行结构鉴定,并对分离得到的量相对较多的黄酮类单体化合物进行抗肿瘤活性筛选。(4)通过查阅文献和实验筛选确定苏铁双黄酮和A549细胞为接下来的实验对象,台盼蓝染色法检测苏铁双黄酮对正常肺上皮细胞BEAS-2B的毒性作用,用梯度浓度的苏铁双黄酮作用于A549细胞,以MTT法检测药物对细胞的生长抑制情况;采用5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EDU)和平板集落形成实验来进一步观察苏铁双黄酮是否能够抑制A549细胞增殖;通过细胞划痕实验检测苏铁双黄酮对A549细胞迁移能力的影响,通过Transwell实验检测苏铁双黄酮对A549细胞侵袭能力的影响;以流式细胞技术检测A549细胞的周期分布状况、胞内的ROS水平以及线粒体膜电位的变化;以Annexin V-FITC/PI双染法、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡的水平;透射电镜观察细胞中自噬体的形成;吖啶橙染色法检测苏铁双黄酮对自噬溶酶体形成的作用。(5)通过RT-PCR法检测苏铁双黄酮对A549细胞VEGF、TNF-α、NF-κB、Vimentin、Snail、N-cadherin、PI3K、AKT、Beclinl、Atg5、Atg7和P62mRNA表达的影响;通过Western blot法分析测定VEGF、TNF-α、NF-κB、Snail、MMP-9、MMP-13、E-cadherin、HIF-1α、PI3K、AKT、Bax、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-Raptor、p-P70S6K的蛋白表达水平,自噬重要因子LC3、p62蛋白的表达情况;通过免疫荧光法分析测定Angiostatin、E-cadherin、HIF-1α、MMP-9、MMP-13 和 LC-3 的表达量情况。(6)进一步使用激活剂IGF-1和抑制剂LY294002来确定苏铁双黄酮是否抑制PI3K/Akt通路,同时采用分子对接技术验证苏铁双黄酮和PI3K、Akt和mTOR之间的对接情况。结果:(1)确定了苏铁叶原植物形态、性状、显微和薄层色谱的主要鉴别特征。(2)苏铁总黄酮高、中、低各剂量组、顺铂给药组和联合给药组的Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤质量与模型组比较均降低,差异具有显著意义(p0.01)。ELISA法检测结果显示,与模型组比较,苏铁总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组、顺铂给药组和联合用药(顺铂+苏铁总黄酮中剂量)组的Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清中的白介素-2(IL-2)的表达水平明显增加,除了苏铁总黄酮中剂量组外,其他各组的白介素-10(IL-10)的表达水平也明显增加。免疫组化法、Western blot法和RT-PCR法的检测结果基本一致,与模型组比较,苏铁总黄酮各给药组VEGF、bFGF、HIF-1α、NF-κB mRNA的表达量和对应的蛋白表达率均降低,差异具有显著性(p0.05)。(3)通过对苏铁的二氯甲烷萃取部位进行分离纯化,得到了 18个单体化合物,根据核磁波谱和文献数据等,其中,10个单体化合物的结构被明确,分别是:4-羟基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde,1)、香草醛(4-hydro xy-3-methoxybenzaldehyde,2)、、2-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)pr opan-1-one(3)、穗花杉双黄酮(Amentoflavone,4)、4-(4-(benzo[d][1,3]dio xol-5-yl)tetrahydro-1 H,3H-furo[3,4-c]furan-1-y1)-2-methoxyphenol(5)、4-[(2R,3R,4S,5S)-5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,4-dimethyloxolan-2-yl]-2-methox yphenol(6)、、(4aS,10aR)-6-hydroxy-1,1,4a-trimethyl-7-propan-2-yl-3,4,110,10 a-tetrahydrophenanthrene-2,9-dione(7)、苏铁双黄酮(sotetsuflavone,8)、6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one(9)、柚皮素(5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one,10)。(4)(0～160)μmol/L的苏铁双黄酮对正常肺上皮细胞BEAS-2B的存活无明显的影响,其毒性作用较小,当苏铁双黄酮的处理浓度达到200μmol/L时,正常肺上皮细胞BEAS-2B的死亡率增加,与对照组(0μmol/L)比较,结果具有极其显著性差异(p0.01)。苏铁双黄酮对A549细胞有显著的抗增殖活性,与此同时,细胞内的ROS含量明显增加,线粒体膜电位下降,Bcl-2/Bax的比例降低,细胞内的cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cytochrome C 和 Bax的表达上调;Cyclin D1、CDK4、Bcl-2 等水平下调。发现苏铁双黄酮能够有效抑制G0/G1期的周期进展,随后诱发内源性凋亡途径。(5)苏铁双黄酮能够抑制A549细胞的转移,此外,还可以抑制A549细胞上皮-间质转化(EMT),反映在E-cadherin的上调,N-cadherin、Vimentin、Snail的下调。在机理上,实验结果表明,HIF-1α在苏铁双黄酮抗非小细胞肺癌A549细胞转移中起重要作用,其不仅可以介VEGF的表达,使VEGF下调、Angiostatin上调,同时,还可以影响MMPs的表达,使MMP-9和MMP-13下调。更重要的是,HIF-1α的表达可能是通过PI3K/AKT和TNF-α/NF-KB途径的抑制来调节的。(6)苏铁双黄酮介导的非小细胞肺癌细胞A549细胞中PI3K/Akt/mTOR途径的阻断通过降低PI3K、Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化水平得到证实。通过用20ng/mLIGF-1处理,苏铁双黄酮对PI3K/Akt信号传导途径的抑制作用被逆转,与此相反,苏铁双黄酮与20μMLY294002联合治疗非小细胞肺癌A549细胞组显著增加了 LC3-Ⅱ的转换。(7)苏铁双黄酮可以通过氢键以及π-H相互作用与PI3Kp85α结合,其中的重要残基包括Glu342、Ser429和Lys346;苏铁双黄酮可以通过氢键、π-H以及π-π相互作用与Akt1结合,其中的重要残基包括Asn53、Thr82、Gln203、Gln79和Trp80;苏铁双黄酮可以通过氢键相互作用与mTORc1结合,其中的重要残基包括Trp2023、Glu2014和Met2010。结论:(1)苏铁叶的主要鉴别特征可为苏铁叶的生药鉴定、质量标准的制定提供依据。(2)苏铁总黄酮可以调节免疫细胞因子白介素-2和白介素-10的表达水平,抑制Lewis肺癌模型小鼠肿瘤细胞的生长和转移并提高其免疫功能。苏铁总黄酮治疗肺癌的作用机制可能为:通过抑制侵袭转移相关VEGF、bFGF、HIF-1α和NF-κB mRNA的表达,进一步抑制其对应的功能蛋白的表达,从而发挥抑制肺癌侵袭和转移作用。(3)鉴定出来的10个化合物中,化合物(4)、(8)和(10)为黄酮类化合物,化合物(1～3)、(5～7)和(9)为首次从该属植物中分离得到,其中,化合物(4)和(8)为双黄酮类化合物。(4)苏铁双黄酮可以通过上调胞内ROS水平并使线粒体膜电位崩溃而诱发G0/G1期的周期阻滞与内源性凋亡,最终抑制A549细胞的生长。(5)苏铁双黄酮可以逆转EMT,从而抑制A549细胞的迁移和侵袭,这一过程可能与PI3K/AKT和TNF-α/NF-κB通路有关。(6)苏铁双黄酮诱导的自噬与非小细胞肺癌细胞中PI3K/Akt/mTOR途径的失活有关。(7)苏铁双黄酮可以和蛋白PI3Kp85α、Akt1 以及mTORc1产生相互作用,其结合能力排序为PI3Kp85αAkt1mTORc1。
【学位授予单位】：中央民族大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R29
【图文】：

图１－１．常见黄酮类化合物的基本结构及其糖基化位点［２Ｇ］。常见的糖基化位点是Ｃ３和Ｃ７邋（黑色箭逡逑头）。Ｂ环在一些植物中也观察到糖基化（空心箭头）。Ｃ６和Ｃ８糖基化在植物中最为少见（虚线箭逡逑头）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｂａｓｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｃｌａｓｓｅｓ邋ｏｆ邋ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｐｏｉｎｔｓ邋ｏｆ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．逡逑Ｃｏｍｍｏｎ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ邋ｐｏｉｎｔｓ邋ａｒｅ邋Ｃ３邋ａｎｄ邋Ｃ７邋（ｂｌａｃｋ邋ａｒｒｏｗｓ）．邋Ｂ邋ｒｉｎｇ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ邋ｉｓ邋ａｌｓｏ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｉｎ邋ｓｏｍｅ逡逑ｐｌａｎｔｓ邋（ｈｏｌｌｏｗ邋ａｒｒｏｗ）．邋Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ邋ａｒｅ邋ｌｅａｓｔ邋ｆｏｕｎｄ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋（ａｒｒｏｗ邋ｗｉｔｈ邋ｄｏｔｔｅｄ邋ｌｉｎｅｓ）．邋Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ逡逑ｍｏｓｔｌｙ邋ｏｃｃｕｒｓ邋ａｔ邋ｔｈｅ邋Ｃ６邋ａｎｄ邋Ｃｓ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ．逡逑二、黄酮类化合物的植物分布逡逑黄酮类化合物的分布较为广泛，通过Ｐ／５ｅｎｏ／－￡ｘｐ／ｏｒｅ；＂邋（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｌ－ｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｅｕ／）进逡逑行检索，在检索的４００种食物中，共有４９２种不同的黄酮和异黄酮类成分，便可略窥逡逑一二，那么，在植物中，黄酮类化合物的分布就更多。对黄酮类化合物的植物来源进行逡逑整理，，、豆、、，此

科苏铁属植物，其化学成分主要是双黄酮类化合物、苏铁甙和氨基酸等＾１。近年来研究逡逑者从苏铁中分离得到的化合物成分。（见表１－２）。近几年来研究者从苏铁屮分离得到的逡逑化合物的结构式。（见图１－２）。逡逑表１－２近年来从苏铁中分离得到的化合物。逡逑Ｔａｂ．邋１－２邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｃｙｃａｓ邋ｒｅｖｏｌｕｔａ邋ｉｎ邋ｒｅｃｅｎｔ邋ｙｅａｒｓ．逡逑编号逦化合物名称逦参考文献逡逑１逦（－）－黑麦草内酯逦［１５５．逦１５６］逡逑２逦（２Ｓ，邋２＂邋Ｓ）－２，３，２＂，３＂－四氢异银杏双黄酮逦［１５７］逡逑３逦（２Ｓ）－橘皮素逦［１５８］逡逑４逦（２Ｓ，２＂邋Ｓ）－２，３－二氢－４’，４＂’－ｄｉ－０－甲基穗花杉双黄酮逦［１５９］逡逑５逦（＋）－（７Ｓ，８Ｒ）－二氢去氢二松柏醇（３’－ｍｅｔｈｙｌｃｅｄｒｕｓｉｎ）逦［１６０］逡逑６逦（２Ｓ，２〃邋Ｓ）－２．３，２＂，３〃邋－四氢－４’－０－甲基穗花杉双黄酮逦［１５７］逡逑７逦（２Ｓ）－２．３－二氢－４’－０－甲基穗花杉双黄酮逦［１６１］逡逑８逦（２Ｓ）－２，３－二氢扁柏双黄酮逦［１６１］逡逑９逦４＿．４＿＂－二－０－甲基穗花杉双黄酮（异银杏双黄酮）逦［１６１］逡逑１０逦４’－０－甲基穗花杉双黄酮（白果素）逦［１６丨

患者３８７０００和１８３０００名女性患者，男性和女性死亡率分别为５５．７１邋／邋１００，０００和逡逑２２．７０邋／邋１００，０００。通过回顾２００７年至２０１２年［？］的肺癌发病率和死亡率情况，发现逡逑农村和城市的肺癌发病率和死亡率均呈上升趋势（见图１－３邋ａ－ｅ）＝与２０１１年相比，２０１２逡逑年男性和女性肺癌的发病率分别为３．８１／邋１００．０００和３．６６／邋１００，０００，而２０１２年的增长逡逑率分别为５．９６％和１１．４６％邋（见图ｌ－３ａ，邋ｂ）。近年来，城市肺癌发病率急剧上升，例逡逑如，２０１２年北京共报告了邋８２２０例新发肺癌病例，占新发恶性肿瘤病例的２０．３９％，其逡逑中５０４３例病例为男性，发病率为７７．９４／１００，０００，女性为３１７７，发病率为４９．５９／１００，０００，逡逑男女比例为１５９：丨００［｜９９］。随着发展中国家人民生活水平的提高和饮食结构的变化，肺癌逡逑的发病率大大增加，肺癌己经成为我国恶性肿瘤死亡的必然原因，肺癌患者的发病率呈逡逑逐渐增加的趋势，成为我国的一个重大的公共卫生问题。逡逑通过整理文献数据发现

本文编号：2788539