目的:探讨头穴丛刺结合丰富环境对孤独症大鼠炎症损伤及细胞凋亡的影响。方法:参照Roullet的方法建立孤独症大鼠模型。设立假手术组、模型组、头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组。假手术组与模型组不予治疗,头穴丛刺组给予头穴丛刺治疗,丰富环境组给予丰富环境治疗,头穴丛刺结合丰富环境组给予头穴丛刺结合丰富环境治疗,采用旷场实验评估焦虑情绪,埋珠实验评估重复刻板行为,三箱实验评估社交能力和社交偏好,Morris水迷宫评估空间学习记忆能力。HE及Nissl染色检测额叶炎性损伤、神经元形态及数量;ELISA法检测血清促炎性因子IL-1β、TNF-a,抑炎性因子IL-1Ra、TGF-β1;免疫组化法检测额叶促炎性因子IL-1β、TNF-a,抑炎症性因子IL-1Ra、TGF-β1蛋白表达;TUNEL法检测额叶细胞凋亡情况;Western Blot法检测额叶Ras、Mek1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果:1.行为学评估:(1)旷场实验与假手术组相比,模型组自发活动距离和时间延长(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组自发活动距离和时间减少(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组自发活动距离和时间最短(P0.05)。(2)埋珠实验与假手术组相比,模型组埋珠个数多(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组埋珠个数少(P0.05);与丰富环境组、头穴丛刺组比较,头穴丛刺结合丰富环境组埋珠个数少(P0.05)。(3)三箱实验3.1与假手术组相比,模型组的社交指数和社交偏好指数均小(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组社交指数和社交偏好指数增大(P0.05),与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组的社交指数和社交偏好指数最大(P0.05)。3.2与假手术组相比,模型组的社交Sniff和社交偏好Sniff均少(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组社交Sniff和社交偏好Sniff均增大(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组的社交Sniff和社交偏好Sniff最大(P0.05)。(4)Morris水迷宫4.1定位巡航实验:与假手术组比较,模型组探索平台次数少(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组探索平台的次数多(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组探索平台的次数多(P0.05)。4.2空间探索实验:与假手术组比较,模型组穿越平台次数少(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组穿越平台次数增多(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组穿越平台次数多(P0.05)。2.HE染色假手术组大鼠额叶细胞未见炎症细胞的浸润及水肿。细胞排列均匀、紧密,轮廓清楚,胞核染色为蓝色,呈椭圆形,可见核仁,未见神经细胞变性坏死。模型组可见明显的炎症细胞浸润,细胞水肿,胶质细胞增生。细胞排列紊乱,细胞间隙变大,细胞结构模糊或消失,存在神经元细胞变性、坏死、崩解,核固缩,甚至有软化灶。3组干预组治疗后炎性病理损伤均有所减轻,头穴丛刺结合丰富环境组减轻最为明显。3.Nissl染色与假手术组相比,模型组额叶神经元存活数量减少(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组额叶神经元数量增加(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组额叶神经元数量最多(P0.05)。假手术组神经元数目最多,额叶细胞结构完整,胞体无萎缩、尼氏体数量多,无溶解现象,胞浆深染;模型组神经细胞数量最少,细胞结构破坏明显,正常神经元细胞少见,胞体萎缩,尼氏体数量明显减少;经过3种干预治疗后,神经元损伤均有所减轻,其中以头穴丛刺结合丰富环境组最为明显。4.ELISA检测促炎性因子IL-1β和TNF-a:与假手术组比较,模型组血清IL-1β和TNF-a表达升高(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组表达降低(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组相比较,头穴丛刺结合丰富环境组表达最低(P0.05)抑炎性因子IL-1Ra和TGF-β1:与假手术组比较,模型组血清IL-1Ra和TGF-β1明显降低(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组表达升高(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组相比较,头穴丛刺结合丰富环境组表达最高(P0.05)。5.免疫组化法促炎性因子IL-1β和TNF-a:与假手术组比较,模型组额叶IL-1β和TNF-a表达增加(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组表达降低(P0.05),与头穴丛刺组、丰富环境组相比,头穴丛刺结合丰富环境表达最低(P0.05)。抑炎性因子IL-1Ra和TGF-β1:与假手术组比较,模型组额叶IL-1Ra和TGF-β1表达降低(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组表达增多(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组相比,头穴丛刺结合丰富环境组表达最多(P0.05)。6.TUNEL法检测与假手术组相比,模型组额叶TUNEL阳性数量增多(P0.05);与模型组相比,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组TUNEL阳性细胞数减少(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境大鼠额叶TUNEL阳性细胞数最少(P0.05)。7.Western Blot法检测促凋亡Bax:与假手术组比较,模型组额叶Bax蛋白表达增加(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组额叶Bax蛋白表达明显减少(P0.05),与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组Bax蛋白表达最少(P0.05)。抑凋亡Bcl-2:与假手术组比较,模型组额叶Bcl-2蛋白表达明显减低(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组额叶Bcl-2蛋白表达均明显升高(P0.05);与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组Bcl-2表达最多(P0.05)。Bcl-2/Bax:五组比值中,假手术组最大,模型组减低;与模型组比较,头穴丛刺、丰富环境、头穴丛刺结合丰富环境治疗后Bcl-2/Bax比值明显升高;接近于1,其中头穴丛刺结合丰富环境组Bcl-2/Bax比值最高。Ras/ERK1/2通路:与假手术组比较,模型组额叶Ras、Mek1/2及p-ERK1/2蛋白表达增加(P0.05);与模型组比较,头穴丛刺组、丰富环境组、头穴丛刺结合丰富环境组表达减少(P0.05),与头穴丛刺组、丰富环境组比较,头穴丛刺结合丰富环境组表达最少(P0.05)。结论:1.头穴丛刺结合丰富环境可改善丙戊酸钠诱导的孤独症大鼠焦虑情绪、刻板行为、社会交往、认知学习记忆能力,优于单一的头穴丛刺组和丰富环境组。2.头穴丛刺结合丰富环境可降低丙戊酸钠诱导的孤独症大鼠炎症反应,抑制血清和额叶脑组织的促炎性因子TNF-a、IL-1β、增强抑炎性因子TGF-β1、IL-1Ra表达,降低额叶区细胞炎性损伤,发挥神经保护作用。3.头穴丛刺结合丰富环境可减少丙戊酸钠诱导的孤独症大鼠额叶细胞凋亡数目,促进额叶Bcl-2表达,抑制Bax、Ras、MEK1/2、p-ERK1/2表达,降低细胞凋亡。
【学位单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R245
【部分图文】：
实验中的表现。结果表明，模型鼠的自发活动增加，对新奇物体的探力以及社交行为均有所下降，这进一步验证了该方法的可靠性。.5 丰富环境建立依 据 前期 研 究 和 参 照 Nithianantharajah 的[118]描 述 自制 有 机 玻 璃 丰境（enrichedenvironment，EE）笼, 规格：长 70cmｘ宽 60cmｘ高 50c富环境体现在以下几个方面：触觉、视觉、嗅觉、前庭觉、本体觉等感官刺激的综合输入、空间增大、饰物定期更换、社交伙伴增多。笼置各种颜色、气味、形状、质地的物件，例如软硬不同的毛刷、有刺气味的柠檬、薄荷棉球等、不同质感的砂纸、静音跑轮、透明发光弹、秋千、跷跷板、平台隧道、斜坡等“玩具”。丰富环境中除放入孤独，也以 1：1 的方式放入正常同龄雌性大鼠，每次丰富环境中有 12-14。丰富环境中的食和水一直在固定的位置，偶给与花生、葵花籽。每新布置一次环境。丰富环境训练结束后，所有鼠将放置在小笼子（长 20宽 15cmｘ高 10cm）里。
2.实验方法2.1 实验分组本研究选择雄性大鼠 30 只，根据行为学检测结果，依据匹配原则将大鼠分为假手术组(CON）、模型组(VPA)、头穴丛刺组(COSA)、丰富环境组（EE）、头穴丛刺结合丰富环境组（COSA＋EE），每组 6 只。生长发育和行为学检测结果的各项指标进行比较，组间无统计学差异。2.2 干预方法假手术组及丙戊酸钠模型组： 术后回笼观察，不予任何治疗；只给予同等条件活动。头 穴 丛 刺 组 ： 生 后 21 天 头 穴 丛 刺 法 治 疗 。 采 用 1.0 寸 针 灸 针（0.25×0.13mm），参照《实验针灸学》定位百会穴及旁开 5mm 处针刺，刺入 10-20mm，快速捻转 20 秒后，留针 2h。1 次/天，6 次/周，干预 3 周[119](图 2AB)。
图 3 旷场实验结果A 假手术组；B 模型组；C 头穴丛刺组；D 丰富环境组；E 头穴丛刺结合丰富环境组；F 自发活动距离；G 自发活动时间3.2 埋珠实验埋珠实验主要用来评估孤独症大鼠的评估重复刻板行为。与假手术组比较，模型组大鼠的重复刻板行为明显增加，有显著差异（P＜0.05），说明丙戊酸钠造成了大鼠重复刻板行为的增多；与模型组相比，经头穴丛刺、丰富环境、头穴丛刺结合丰富环境治疗后，三个干预组大鼠重复刻板行为都明显减少，差异显著（P＜0.05），其中以头穴丛刺结合丰富环境组重复刻板行为减少最明显，与头穴丛刺组、丰富环境组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明这三种疗法均可改善因丙戊酸钠造成的重复刻板行为增多，且以二者联合治疗效果最好（图 4）。
【参考文献】
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本文编号：
2808927
