救必应酸对念珠菌的作用机制研究及救必应溶液对念珠菌性间擦疹病的临床疗效评价

发布时间：2020-09-12 11:48

　　白色念珠菌是寄生于70%健康人皮肤、生殖器、肠粘膜的正常菌群的一部分,在一定条件下可能导致皮肤粘膜或全身感染。近年来,随着广谱抗生素的广泛应用以及介入诊断和器官移植治疗技术的发展,白色念珠菌的感染率呈上升趋势,同时非白色念珠菌菌株不断增加,目前,对常用的抗真菌药物耐药的念珠菌菌株数量不断增加,给临床治疗带来很大困难。念珠菌性间擦疹是发生在腋窝、乳房下、腹股沟等皮肤部位,以红斑、糜烂、渗出、脓疱为主要特征,主要由白念珠菌局部感染引起的真菌性皮肤病,近年来发病率不断上升。湿润和浸渍的皮肤褶皱是白色念珠菌生长的有利因素,且念珠菌具有多形性,可在不同条件下进行形态转换,并且可以形成生物膜,以此来逃避人免疫细胞的识别及对抗抗真菌药物的杀伤作用。中医学有“湿热生虫”的理论,并将念珠菌归属于虫邪范畴,苦寒燥湿法是中医学治疗感染性疾病的重要方法。随着念珠菌对现存抗真菌药物耐药性的不断增加,寻找广谱、高效、低毒的抗念珠菌药物已成为国内外医学界的热门话题。我国的中草药资源丰富,在预防和治疗念珠菌感染方面具有一定的优势。中药在化学结构和作用机制方面均存在多样性,值得我们去深入挖掘探索。深入了解念珠菌的生物学特点、致病特点,了解抗真菌药物的作用靶点,结合中医药的理论及中药的性质,利用现代中药学及现代的分子生物学手段,开发研究新的抗念珠菌药物极具价值。本研究根据中医理论及现代中药学理论,选择具有苦寒性质的中药救必应为研究对象,观察救必应溶液对念珠菌性间擦疹的临床疗效,探讨救必应酸抑制白色念珠菌的作用机理,为开发新的抗念珠菌药物奠定基础。目的:观察救必应溶液对念珠菌性间擦疹的临床疗效,探讨救必应酸抑制白色念珠菌的作用机理。方法:本研究主要由四部分组成1.观察救必应溶液对念珠菌性间擦疹的临床疗效。本研究采取随机对照原则,选取我科120例符合标准的念珠菌性间擦疹患者随机分为治疗组和对照组各60例,治疗组:给予救必应溶液冷湿敷患处,每次20分钟,每天3次;对照组:氟康唑注射液冷湿敷患处,每次20分钟,每天3次。1周为1疗程,观察2个疗程。观察治疗过程中皮损症状积分的变化,比较临床总有效率和真菌转阴率。2.采用划线转种科玛嘉显色培养基对念珠菌性间擦疹菌株进行鉴定。3.微量液基稀释法测定救必应酸对四种念珠菌的最低抑菌浓度和白色念珠菌最低抑制生物膜浓度。通过救必应酸干预后对四种念珠菌属的生长曲线的变化研究救必应酸的抑菌效能。4.通过透射电镜观察救必应酸对白色念珠菌细胞结构的影响、碘化丙啶染色法观察细胞膜通透性的变化、高效液相色普法观察救必应酸对麦角固醇含量的影响。5.Weston-blot、RT-PCR探索救必应酸对白色念珠菌Ras-cAMP-PKA通路关键基因Ras1、Cdc35、Tpk1和RAS1、CDC35、TPK1蛋白表达的影响。结果:1.治疗2个疗程,治疗组总有效率77.8%,对照组治疗总有效率88.0%,治疗组略低于对照组,但两组总有效率无明显差异(P0.05)。与治疗前比较,两组皮损症状评分均低于治疗前(P0.05),但两组间皮损症状评分比较无统计学意义(P0.05)。2个疗程后治疗组转阴率77.8%,对照组转阴率88.0%,两组真菌转阴率无显著差异(P0.05)。两组均未见明显的不良反应。2.从门诊念珠菌性间擦疹患者中分离和鉴定的104株念珠菌中,白色念珠菌共67株,占总数的66.4%,非白色念珠菌占总数的33.6%。3.通过微量液基稀释法考察救必应酸对4种念珠菌共16株念珠菌的MIC,结果显示:救必应酸对白色念珠菌4种菌株的MIC范围为8-32μg/mL;对白色念珠菌菌株CCZYY002 SMIC50为256μg/mL;救必应酸对热带念珠菌的4种菌株MIC为32-128μg/mL;救必应酸对光滑念珠菌的MIC为32-128μg/mL;救必应酸对克柔念珠菌的MIC为128-256μg/mL。救必应酸浓度介于8-1024μg/mL时,对四种念珠菌属生长曲线有不同程度的影响。不同浓度的救必应酸均能平稳抑制四种念珠菌的生长。4.透射电镜下救必应酸可使白色念珠细胞细胞壁变薄,细胞核碎裂,胞质分散导致细胞死亡。碘化丙啶染色发现,256μg/mL、512μg/mL救必应酸分别导致9.232±2.6%和23.703±3.2%的PI阳性细胞,与空白对照组比较具有显著性差异(P0.05)。256μg/mL的救必应酸处理后的白色念珠菌细胞膜中的麦角固醇下降至5.60±1.02μg/mL,与生长对照组比较差异显著(P0.05)。5.通过q RT-PCR检测,结果发现经256μg/mL救必应酸干预后,白念珠菌胞内部分氧化还原相关基因Ras1、Cdc35、和Tpk1的转录水平也有不同程度的变化,其中Ras1,Cdc35和Tpk1分别下调了38%和30%和26%。Western blot结果表明,在生物被膜12 h,救必应酸处理后的白色念珠菌菌株RAS1、CDC35、TPK1蛋白表达均下调,与空白组相比,下调36%和27%和24%。实验结论:1.救必应溶液冷敷治疗念珠菌性间擦疹可有效改善患者临床症状,抑制皮肤念珠菌生长,促进真菌转阴,无不良反应。2.本机构医院中念珠菌性间擦疹感染以白色念珠菌为主,非白色念珠菌占一定比例。3.救必应酸对四种念珠菌的最低抑菌浓度不同,对生长曲线产生一定影响。4.救必应酸可破坏白色念珠细胞结构导致细胞死亡,碘化丙啶染色发现PI阳性细胞增加。其作用机制可能是影响白色念珠菌细胞膜中的麦角固醇合成导致细胞膜通透性增加,进而导致细胞死亡。5.救必应酸可下调Ras-cAMP-PKA通路上部分关键基因Ras1、Cdc35、Tpk1和RAS1、CDC35、TPK1蛋白表达进而抑制白色念珠菌菌丝及生物膜的形成。
【学位单位】：长春中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R275.9
【部分图文】：

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图 1 救必应酸对白色念珠菌 CCZYY002、光滑念珠菌 CCZYY005、热带念珠菌 CCZYY011和克柔念珠菌 CCZYY015 生长曲线的影响4 讨论耐药菌株的选择性生长可能是长期使用抗真菌药物的结果，导致带菌状态的形成，增加耐药菌株的传播机会。真菌的耐药的方式主要包括真菌的内在耐药性、真菌耐药菌株的自然选择、真菌敏感菌株的变异。提高药物使用的针对性、减少抗真菌药物的接触对减少真菌耐药性的产生具有重要意义[136]。近年来，白念珠菌仍然是感染率最高的念珠菌，但是非白念珠菌类感染率逐渐升高。研究发现临床上不同念珠菌对抗真菌药物耐药的易感性存在差异，不同念珠菌的耐药机制不同[137]。本研究发现救必应酸对白色念珠菌 4 种菌株的 MIC 值最低，这与文献报道相似。不同地区、人群、以及抗真菌药物的使用情况不同导致了不同耐药菌株对抗真菌药物的敏感性不同。有研究调查发现 359 株白念珠菌敏感率为伊曲康唑 89.1%、特比萘芬 7.2%、制霉菌素 96.9%、两性霉素 B94.4%、氟胞嘧啶 90.0%。说明白色念珠菌对大多数抗真菌

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图 2a 图 2b图 2 透射电镜观察救必应酸处理后白色念珠菌生物膜细胞的超微结构.2 救必应酸对白念珠菌生物膜细胞的结构损伤产生影响本实验发现，256 μg/mL、512 μg/mL 救必应酸分别导致 9.232±2.6%和 23.703±3.2细胞凋亡，与空白对照组比较具有显著性差异（P<0.05）。因此救必应酸可显著增色念珠菌的凋亡，其机制可能与改变细胞膜结构以及影响细胞膜通透性有关，并具定的剂量依赖性。

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细胞中显示低二倍体核型特征。根据光散射的特点，PI 染色可以区分凋亡细胞峰和坏细胞峰。当细胞坏死时，大部分细胞肿胀，正光散射高于正常值，对侧光散射高于正值。细胞坏死是外部环境作用下的被动过程。3.3 救必应酸可降低白念珠菌细胞膜麦角固醇含量真菌细胞膜结构的完整性、流动性、细胞通透性、结合酶的功能以及物质运输等能与麦角甾醇密切相关。因此，抑制麦角甾醇的生物合成可破坏真菌的细胞膜结构，而起到抗真菌作用。我们应用高效液相色谱法（HPLC）测定白色念珠菌细胞膜中的角固醇含量。与麦角固醇标准品的液相色谱图的出峰时间和峰面积相对照，生长对照的麦角固醇含量为 7.32±1.13 μg/mL，256 μg/mL 的救必应酸处理后的白色念珠菌细膜中的麦角固醇下降至 5.60±1.02 μg/mL，与生长对照组比较差异显著（P<0.05）。μg/mL 的氟康唑处理组作为阳性对照，麦角固醇下降最明显，下降至 3.64±0.58 μg/m对白色念珠菌细胞膜中的麦角固醇含量抑制效果强于救必应酸。

【参考文献】