基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案的临床疗效观察及调节肠道微生态的机制研究

发布时间：2020-10-18 10:36

　　 目的:1.采用随机对照临床试验(RCT),对比观察基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案的临床疗效,提供较高级别的循证医学证据。2.采用16SrDNA技术研究基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案对患者肠道菌群多样性的影响,探讨基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案通过调节肠道微生态改善肝再生微环境的疗效机制。方法:1.采用随机对照临床试验将2017年5月至2019年1月湖北省中医院肝病门诊及病房确诊为晚期肝癌的患者111例分为西医对照组(西医治疗组,37例,采用西医常规治疗方法),“补肾生髓成肝”综合治疗组(西医治疗组基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减,37例)和“补肾生髓成肝”单独治疗组(地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗组,37例);“补肾生髓成肝”综合治疗组方案和“补肾生髓成肝”单独治疗组方案合称基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心(世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构)完成临床试验注册,注册号:ChiCTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。比较西医对照组、“补肾生髓成肝”综合治疗组、“补肾生髓成肝”单独治疗组三组患者治疗3个月及6个月后的生存率;三组患者治疗3个月后的实体瘤疗效、中医证候积分,生存量表积分,并观察患者治疗3个月后临床生化指标(ALT、AST、TBil、ALB、WBC、PLT、NLR、PT、PTA)的改善情况;2.本研究进一步收集30例患者粪便标本,10例正常人粪便。以Illumina MiSeq为测序平台,利用Mothur、Graphpad、R语言、Metastats分析等软件对其16SrDNA V3-V4区的肠道菌群可操作分类单元(OTUs)数量,alpha与beta多样性,丰富度指数(CHAO、ACE)与多样性指数(Simpson、Shannon)以及差异菌门与菌属、肠道菌群组间差异比较进行综合性分析与评价;结果:1.三组患者治疗前后生存率比较:治疗3个月后“补肾生髓成肝”综合治疗组的生存率为85.71%,“补肾生髓成肝”单独治疗组的生存率为68.57%,西医对照组的生存率为47.05%,三组比较有统计学差异(P0.05);治疗6个月后“补肾生髓成肝”综合治疗组的生存率为68.57%,“补肾生髓成肝”单独治疗组的生存率为54.28%,西医对照组的生存率为32.35%,三组比较有统计学差异(P0.05);2.三组患者治疗前后实体瘤疗效比较:治疗12周后采用RECIST1.1标准进行短期疗效评价,无一例患者获得完全缓解(CR);获稳定(SD)的患者比例为17.65%(6/34)、34.29%(12/35),28.57%(10/35);评价为部分缓解(PR)的患者比例为8.82%(3/34)、14.28%(5/35),11.43%(4/35);评价为恶化(PD)的患者比例为73.53%(25/34)、51.43%(18/35),60%(21/35);西医对照组和“补肾生髓成肝”综合治疗组、“补肾生髓成肝”单独治疗组的实体瘤疗效为26.47%、48.57%、40%;SD及实体瘤疗效补肾生髓成肝组(包括综合治疗组和单独治疗组)与西医对照组比较有统计学差异(P0.05);3.三组患者治疗前后中医证候积分比较:治疗12周后三组患者的中医证候积分均明显下降,补肾生髓成肝综合治疗组的中医证候积分下降最为显著,与补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(22.23±3.58vs25.38±4.34vs27.13±5.80(P0.05);说明“补肾生髓成肝”第三级预防方案能明显改善患者临床症状,其主要表现在改善患者脘闷腹胀、胸胁疼痛、倦怠乏力、腰膝酸软等方面;4.三组患者临床生化指标比较:治疗12周后补肾生髓成肝综合治疗组患者ALB显著升高,同补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(38.86g/L±6.29g/LVS37.31g/L±6.01 g/L VS33.86 g/L±6.73 g/L)(P0.05);PLT显著升高,同补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(191.29±57.60VS141.88±58.20 VS151.86±98.30)(P0.05);补肾生髓成肝综合治疗组患者TBil显著降低,同补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(26.35μmol/L±34.85μmol/L VS28.96μmol/L±29.32μmol/L VS45.07μmol/L±62.04μmol/L)(P0.05);ALT显著降低,同补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(32.07±20.68 VS41.00±25.8VS64.44±56.33)(P0.05);AST显著降低,同补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(58.9±49.42VS85.75±99.79VS115.56±145.95)(P0.05);NLR显著降低,同补肾生髓成肝单独治疗组和西医对照组比较有统计学差异(3.45±1.94VS5.24±5.93VS4.02±4.38)(P0.05);5.三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者躯体疼痛(BP)、精神健康(MH)、精力(VT)、情感职能(RE)四个维度评分组间比较无统计学差异,而躯体健康(HT)、生理职能(RP)、社会功能(SF)、生理机能(PF)、一般健康状况(GH)五个维度评分补肾生髓成肝综合治疗组同西医对照组和“补肾生髓成肝”单独治疗组比较有统计学意义(P0.05);6.安全性检测:三组患者治疗后血清安全检测无毒副作用,三组患者治疗过程中未发现不良反应及毒副作用;7.OTU分析:40例粪便样本共获得有效序列1363877条,序列有效长度均在420-460bp,测序覆盖率好,在97%的相似水平下分别共获得1299类OTU。实验所构建的各组患者肠道菌群的Specaccum物种累积曲线和丰度等级曲线中所有样本均随着测序深度的增加趋向平坦,测序数据量足够;8.利用所测的OTU、Ace、Chao、Shannon、Simpson等指数对肠道菌群的α多样性分析发现,同正常组比较,肝癌患者的肠道菌群丰富度指数(Chao与ACE)显著减少(P0.05),多样性指数(Simpson与Shannon)显著降低(P0.05);同西医对照组比较,补肾生髓成肝综合治疗组和补肾生髓成肝单独治疗组的肠道菌群丰富度指数(Chao与ACE)显著增加(P0.05)、Simpson指数和Shannon指数显著升高(P0.05);9.测序后各组患者肠道菌群在厚壁菌门(Firmicutes)、Thermi菌门、互养菌门(Synergistetes)、平生菌门(Planctomycetes)、TM7菌门、软壁菌门(tenericutes)、芽单胞菌门(Gemmationadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)出现差异(P0.05);Metastats分析用于比较组间肠道菌群差异性,各组患者治疗前后在门、纲、目、科、属水平均有差异,本研究肝癌患者的肠道菌群内有益菌群数量大幅降低比如:毛螺旋菌科(Lachnospriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、布劳特氏菌属(Blautia)、梭菌目(Clostridiale)等;丰度上升的细菌多为临床上常见的机会性致病菌比如:链球菌(Streptococcus)、肠杆菌(Enterobacteria)、克雷白氏杆菌(Klebsiella)、巨型球菌(Megasphaera)、韦荣球菌(Veillonella)、嗜血杆菌(Haemophilus)等。且补肾生髓成肝综合治疗组和补肾生髓成肝单独治疗组患者经治疗后有益菌布劳特氏菌、梭菌属、双歧杆菌属丰度明显增加(P0.05);有害菌(相炭疽杆菌、克雷白氏杆菌、粪杆菌)丰度降低;10.采用主成分分析(PCA)考察患者肠道菌群β多样性的差异。与正常组比较,西医对照组患者菌群明显分开,表明两组菌群结构具有显著性差异提示西医对照组对肠道微生态改善不明显;补肾生髓成肝综合治疗组与补肾生髓成肝单独治疗组均趋向于正常组,且补肾生髓成肝综合治疗组更接近正常组,说明补肾生髓成肝综合治疗组菌群结构与正常组相近,两者存在一定的亲缘关系说明“补肾生髓成肝”的第三级预防方案能够明显改善患者肠道菌群;11.根据物种丰度矩阵和样本分组数据构建偏最小二乘法-判别分析(PLSDA)模型,分析各组间肠道菌群差异的相互关系。结果发现正常组与西医对照组各自聚类,无交集,说明正常组与西医对照组群落结构多样性无关联性提示西医对照组对肠道微生态改善不明显;补肾生髓成肝综合治疗组、补肾生髓成肝单独治疗组与正常组均有交集,表明这三组之间存在着一定的关联性说明“补肾生髓成肝”的第三级预防方案能够明显改善患者肠道菌群。同时,补肾生髓成肝综合治疗组最接近于正常组,说明这两组间群落结构多样性具有较强的关联性;结论:1.RCT临床研究结果表明:基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案能够显著提高患者3个月及6个月的生存率的同时使患者能够带瘤生存,具有降低NLR和血清总胆红素,升高血清白蛋白和血小板的作用,患者治疗后临床症状明显改善,生存质量显著提高,提示基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案提高治疗晚期肝癌的疗效机制之一可能是通过调控肝损伤/肝再生失衡而改善肝癌的肝再生微环境。2.基于“补肾生髓成肝”肝癌第三级预防方案提高晚期肝癌患者生存率可能疗效机制之一通过增加患者肠道菌群的有益菌降低有害菌从而调节肠道微生态进而改善肝再生微环境以抑制肝癌的发生发展。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R273
【部分图文】：

说明该物种对于组间差异的贡献越大）。3 统计学方法所有数据均运用 Microsoft Excel 软件和统计软件 SPSS19.0 处理，正态分布的计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析组间差异；肠道菌群利用 QIIME、FLASH、Mothur、Graphpad、R 语言、Metastats 等分析软件；4 结果4.1 肠道菌群可操作分类单元( OTUS) 分析：40 例粪便样本共获得有效序列 1363877 条，序列有效长度均在 420-460bp,测序覆盖率好，在 97%的相似水平下分别共获得 1299 类 OUT，见图 3。实验所构建的各组患者肠道菌群的 Specaccum 物种累积曲线和丰度等级曲线中所有样本均随着测序深度的增加趋向平坦，测序数据量足够。见图 1，图 2。

各组患者肠道菌群的Specaccum物种累积曲线

49图 3 各组患者肠道菌群的 OTU 维恩图 肠道菌群的 ALPHA 多样性分析随着样本数量与相应等级值的增加，菌群数量与相对丰度趋于某，表明测序深度充分，足够反映群落丰富度的水平，OTUs 的数际情况，群落组成的均匀度较高，见图 4。利用所测 OUT、Ace、Cnnon、Simpson 等指数对肠道菌群的α多样性分析发现，同正常组比患者的肠道菌群丰富度指数( Chao 与 ACE) 显著减少( P＜0.05)，指数( Simpson 与 Shannon) 显著降低( P＜0.05);同西医对照组比
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本文编号：2846190