针刺对EAE小鼠脑组织JAK2、p-STAT3及血清IL-17表达的影响

发布时间：2020-11-06 19:28

　　 研究目的多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是由免疫介导的中枢神经系统疾病,具有髓鞘脱失、髓鞘再生障碍、轴索损伤和神经变性等特点,以脑和脊髓内白质病理改变为主,导致MS患者严重残疾,其病理生理机制复杂,尚无特效治疗策略。MS经典动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型。本研究采用雌性C57BL/6小鼠EAE模型,探究针刺“大椎”(GV14)、双侧“肾俞”(BL23)、双侧“足三里”(ST36)穴对雌性C57BL/6小鼠EAE模型的治疗作用,并探讨其疗效机制:①脑组织JAK2、p-STAT3的表达变化。②血清中促炎细胞因子白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的表达变化。为深入认识MS的发病机制,并为临床针刺治疗MS提供新的思路及理论支持。研究方法将40只雌性C57BL/6小鼠称重编号后,按随机数字表分成空白对照组、EAE模型组、激素治疗组、针刺治疗组4个组,每组10只。除空白对照组外,其余各组采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55,MOG35-55)混合完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)制备的完全抗原联合百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)将雌性C57BL/6小鼠诱导成EAE模型。空白对照组和EAE模型组,免疫后第14天开始每天抓取、固定一次,并用0.1ml/10g/d生理盐水灌胃,至免疫后第28天取材。针刺治疗组免疫后第14天开始,每天同一时间(上午9:00)针对“大椎”、双侧“肾俞”、双侧“足三里”穴进行针刺治疗,每次留针15分钟,至免疫后第28天取材,共15次。激素治疗组免疫后第14天开始,每天同一时间(上午9:00),对小鼠进行激素冲击疗法,每次醋酸泼尼松混悬液(0.6mg/ml,醋酸泼尼松片用生理盐水配制成要求的浓度)灌胃,0.1ml/10g/d,连续治疗15天。从免疫后第0天开始直到免疫后第28天实验结束取材为止,每天在相同的时间点(下午14:00-16:00)观察小鼠的行为学变化(如毛色、行为及饮食),隔天称量记录小鼠的体质量,记录神经功能缺损评分。免疫后第28天进行眼球采血,取脑,进行脑组织劳克坚牢蓝(Luxol fast blue,LFB)髓鞘染色观察脱髓鞘程度,检测脑组织中JAK2、p-STAT3免疫组化表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-17的含量。研究结果1.体质量及神经功能缺损评分于免疫后第10天,EAE模型组、激素治疗组、针刺治疗组三组小鼠均先后发病,逐渐出现精神萎靡,食欲下降,体重减轻,尾部无力、肢体瘫痪、二便失禁和偶有背部皮肤破溃等,逐渐加重。空白对照组无小鼠发病,体重持续增长,活动度正常。免疫后第0天,各组小鼠体质量和神经功能缺损评分无统计学差异(P0.05);免疫后第14天,与空白对照组相比,EAE模型组、激素治疗组、针刺治疗组的小鼠体质量均持续下降(P0.01),神经功能缺损评分均显著增加(P0.01);免疫后第20天,与EAE模型组相比,激素治疗组、针刺治疗组的小鼠体质量均较高(P0.01)、神经功能缺损评分均较低(P0.01);与激素治疗组相比,针刺治疗组的小鼠体质量无统计学差异(P0.05)、神经功能缺损评分较高(P0.01);免疫后第28天,与EAE模型组相比,激素治疗组、针刺治疗组的小鼠体质量均较高(P0.01)、神经功能缺损评分均较低(P0.01,P0.05);两治疗组相比,针刺治疗组小鼠的体质量较低,且差异有统计学意义(P0.05),神经功能缺损评分无显著差异(P0.05)。2.脑组织LFB髓鞘染色空白对照组小鼠的脑组织LFB髓鞘染色无异常表现,髓鞘致密,排列整齐。EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组小鼠的脑组织可见大小不等的片状髓鞘脱失区,呈空泡样改变,以侧脑室周围最明显。其中EAE模型组,髓鞘脱失最明显,并且存在有大量空泡样变化;激素治疗组、针刺治疗组较EAE模型组髓鞘脱失较少,空泡化程度改变较轻。3.脑组织免疫组化JAK2、p-STAT3脑组织JAK2、p-STAT3免疫组化阳性表达呈黄色。与空白对照组相比,EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组的小鼠脑组织JAK2、p-STAT3的表达水平有显著差异(P0.01);与EAE模型组相比,激素治疗组和针刺治疗组的小鼠脑组织JAK2、p-STAT3的表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.01);针刺治疗组、激素治疗组相比,小鼠脑组织中JAK2、p-STAT3的表达水平无统计学差异(P0.05)。4.血清IL-17与空白对照组相比,EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组的小鼠血清ELISA的IL-17表达水平升高,有显著差异(P0.01);与EAE模型组相比,激素治疗组、针刺治疗组的小鼠血清ELISA的IL-17表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.01,P0.05);针刺治疗组和激素治疗组相比,针刺治疗组的小鼠血清ELISA的IL-17表达水平较高,且差异有统计学意义(P0.05)。结论1.针刺、激素均可显著升高雌性C57BL/6小鼠EAE模型的体质量,以及降低神经功能缺损评分,提示针刺、激素均可改善雌性C57BL/6小鼠EAE模型的临床症状,且两者作用相当。2.EAE模型组、针刺治疗组和激素治疗组脑组织免疫组化JAK2、p-STAT3表达升高,提示JAK2-STAT3信号转导通路影响EAE发病,针刺、激素可显著下调雌性C57BL/6小鼠EAE模型脑组织免疫组化JAK2、p-STAT3表达,提示针刺、激素可调节JAK2-STAT3信号转导通路改善EAE发病,且两者作用相当。3.针刺,激素可显著下调雌性C57BL/6小鼠EAE模型血清IL-17的含量,提示针刺,激素可减轻炎性反应程度,其作用机制可能是通过调节JAK2-STAT3信号转导通路,从而影响IL-17的分泌有关。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R245
【部分图文】：

图２：环境因素会影响免疫系统，从而影响ＭＳ发病和病情。通过影响免疫系统功能，导致神经??炎症攻击中枢神经系统，最终导致ＭＳ。ＡＰＣ、抗原呈递细胞；Ａｂ、抗体：Ｃ、补充；ＣＭＶ、巨细胞??病毒；ＥＢＶ、巴尔病毒；ＧＭ－ＣＳＦ，粒细胞单核细胞集落刺激因子；ｍｙｅｌｉｎ－Ａｇ、髓鞘抗原；ＮＯ，一??氧化氮；ＲＯＳ，活性氧；Ｔｃ、细胞毒细胞；ＴＧＦ－Ｐ、转化生长因子－ｐ；?ＴＨ、辅助Ｔ细胞；ＴＮＦ、肿瘤??坏死因子；Ｔｓ、Ｔ?抑制细胞。［７４］?Ｏｌｓｓｏｎ?Ｔ，Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ?Ｌ?Ｆ，?Ａｌｆｒｅｄｓｓｏｎ?Ｌ．?Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｇｅｎｅｔｉｃ，??ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ?ａｎｄ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ?ｒｉｓｋ?ｆａｃｔｏｒｓ?ｆｏｒ?ｍｕｌｔｉｐｌｅ?ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．?Ｎａｔｕｒｅ?Ｒｅｖｉｅｗｓ?Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，?２０１７，?１３（１）：２５．??３．３．２适应性免疫??目前，ＭＳ发病机制，主要认为其与自身反应性初始性ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的激活有??关，是ＭＳ发病机理中的初始反应和关键。在中枢神经系统中，初始性ＣＤ４＋Ｔ细胞识??别表达ＨＬＡ?ＩＩ型分子的小胶质细胞、浸入的巨噬细胞和Ｂ细胞递呈的抗原。活化的自??身反应性Ｔ淋巴细胞的细胞表面表达的粘附分子，使其能够结合内皮－脑屏障（ＥＢＢ），??同时，活化的Ｔ淋巴细胞产生基质金属蛋白酶（ＭＭＰ），其允许在ＥＢＢ中产生开口，从??Ｔ，

子介导的ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信号转导通路的激活，以此预防此信号转导通路激活过度引起其细??胞增殖、分化、代谢异常和生理功能紊乱，形成负反馈调节。ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信号通路，如??图１、图２［１Ｑ】。??八?Ｃｙｔｏｋｉｎ？??ｙ?／?Ｃｙｔｏｋｉｒ＞ｅ??Ｒｅｃｅｐｔｏｒ??１?ｆｔ???異—??＾?＾?ｋ?Ｇｅｎｅ??ｃ／）?＾?ｊ?＾?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??３２??

Ｋ－ＳＴＡＴ信号传导调节ＣＤ４＋Ｔ细胞的分化。ＣＤ４＋Ｔ细胞根据它们遇到的细同。具体而言，ＩＬ－１２通过激活ＪＡＫ２／ＴＹＫ２和ＳＴＡＴ４诱导Ｔｈｌ细胞分化，ＴＡＴ６诱导Ｔｈ２细胞分化，而丨Ｌ－６和丨Ｌ－２３以及ＩＬ－ｌ?Ｐ通过激活ＪＡＫ１／２和Ｓ化。［１０］?Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ?Ｅ?Ｎ，Ｌｉｕ?Ｙ，?Ｍｃｆａｒｌａｉｉｄ?Ｂ?Ｃ，?ｅｔ?ａｌ．?Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｊａｎｕｓ?Ｋｉｎｄ?Ａｃｔｉｖａｔｏｒ?ｏｆ?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?Ｍｕｌｔｉｐｌｅ?Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?Ａｎｉｍａｌ?Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ?Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］，?Ｊｏｕｒｎａｌ?ｏｆ?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?＆?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ?ｔ?Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ?Ｓｏｃｉｅｔｙ?ｆｏｒ?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?＆?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ，?２０１４，?３４（８）：５７７－５８８．??Ｔ在ＭＳ及ＥＡＥ的作用???ＳＴＡＴ??－ＳＴＡＴ信号转导通路中，ＪＡＫ和ＳＴＡＴ蛋白是在ＥＡＥ动物模型中。ＳＴＡＴ蛋白敲除小鼠己被用于研究不同ＳＴＡＴ蛋白在ＥＡＥ动物模ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信号通路作为炎症和自身免疫疾病的理想治疗靶点备受
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本文编号：2873568