基于脑肠肽及核呼吸因子研究“足三里”穴对脾气虚模型大鼠的调控机制

发布时间：2020-11-13 07:46

　　 目的:早在金元时期,就认为针刺“足三里”穴具有补益脾胃元气、提高胃经气血运行能力之功。本实验将40只SD大鼠随机分为四组,分别为正常组、脾气虚组、足三里组和非经非穴组,除正常组外,其余三组采用“饮食不节”结合“劳倦过度”的复合因素建立脾气虚证大鼠模型。造模成功后,足三里组和非经非穴组分别给予电针双侧“足三里”穴和非经非穴点干预处理7日。应用Q-PCR、ELISA方法检测大鼠下丘脑及小肠组织与能量代谢相关的脑肠肽的基因及蛋白表达,应用Q-PCR、WB方法检测大鼠胃及骨骼肌组织NRF1及NRF2的基因及蛋白表达,旨在从能量代谢角度探讨电针大鼠双侧“足三里”穴对脾气虚大鼠的调控机制,为针灸的临床治疗提供理论依据。材料与方法:40只SD大鼠按随机数字表法分为4组,分别为正常组、脾气虚组、足三里组和非经非穴组,每组10只。所有大鼠于我校动物实验中心适应性饲养7日后,正常组大鼠每日自由饮水进食,其余各组大鼠采用“饮食不节”结合“劳倦过度”复合因素复制脾气虚证候模型,5个周期后大鼠出现食欲不振(食量减少)、神疲乏力、毛色不荣、形体瘦削,嗜睡扎堆等症状,符合《中医实验动物模型方法学》~([1])中对于脾气虚证的评定标准,提示脾气虚证大鼠模型造模成功,开始正常饲养并进行电针干预处理。正常组和脾气虚组每日在操作台上固定20min,不予以其它处理;足三里组给予电针双侧“足三里”穴进行毫针针刺,非经非穴组给予电针双侧“非经非穴点”(双侧髂嵴上10-15mm、后正中线旁开20mm区段内选择一个固定对照点确定为非经非穴点)~([2]),分别以毫针直刺5mm,接华佗牌电针仪(SDZ-Ⅱ型),采用疏密波刺激(密波15Hz,疏波2Hz),电流0.5mA。电针持续20min,每日1次。干预处理7日后,各组大鼠禁食不禁水24h,次日用10%水合氯醛腹腔麻醉(3ml/kg体重)。开腹,取胃及小肠组织用PBS溶液清洗干净,断头取下丘脑组织,剪开大鼠后肢皮肤、取股四头肌组织,所有组织均于液氮浸泡后冻存于-80℃冰箱保存备用。采用Elisa方法检测大鼠下丘脑及小肠组织Ghrelin、VIP、CCK蛋白含量变化;荧光定量PCR方法检测下丘脑及小肠组织Ghrelin、VIP、CCK及其受体的mRNA表达;荧光定量PCR法检测大鼠胃及骨骼肌组织NRF1及NRF2 mRNA表达水平;Western Blot方法检测大鼠胃及骨骼肌组织内NRF1及NRF2蛋白含量变化。实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行处理分析,结果以均值±标准差(`x±s)表示。组间两两比较采用单因素方差分析,组间方差齐采用LSD检验法,方差不齐采用Tamhane’s T2(M)检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。结果:1.各组大鼠脑肠肽及其受体的基因表达1.1各组大鼠Ghrelin及其受体的基因表达统计结果显示:与正常组比较,脾气虚组和非经非穴组大鼠小肠组织Ghrelin含量降低(P﹤0.05),小肠及下丘脑组织Ghrelin及其受体的mRNA表达下调;与脾气虚组相比,足三里组Ghrelin含量升高(P﹤0.05),小肠及下丘脑组织Ghrelin及其受体的mRNA表达上调(P﹤0.05),非经非穴组未见显著性差异(P﹥0.05)。1.2各组大鼠VIP及其受体的基因表达统计结果显示:与正常组比较,脾气虚组和非经非穴组大鼠小肠组织VIP含量降低(P﹤0.05),小肠及下丘脑组织VIP及其受体的mRNA表达下调;与脾气虚组相比,足三里组VIP含量升高(P﹤0.05),小肠及下丘脑组织VIP及其受体的mRNA表达上调(P﹤0.05),非经非穴组未见显著性差异(P﹥0.05)。1.3各组大鼠CCK及其受体的基因表达统计结果显示:与正常组比较,脾气虚组和非经非穴组大鼠小肠组织CCK含量升高(P﹤0.05),小肠及下丘脑组织CCK及其受体的mRNA表达上调;与脾气虚组相比,足三里组CCK含量降低(P﹤0.05),小肠及下丘脑组织CCK及其受体的mRNA表达下调(P﹤0.05),非经非穴组未见显著性差异(P﹥0.05)。2.各组大鼠胃及骨骼肌组织内NRF1及NRF2的基因表达统计结果显示:与正常组比较,脾气虚组和非经非穴组大鼠胃和骨骼肌组织内NRF1及NRF2蛋白表达显著减少,NRF1及NRF2 mRNA表达明显下调(P﹤0.01);与脾气虚组相比,足三里组大鼠胃和骨骼肌组织内NRF1及NRF2蛋白表达显著增加,NRF1及NRF2 mRNA表达明显上调(P﹤0.01),非经非穴组未见显著性差异(P﹥0.05)。结论:1.针刺“足三里”穴通过调节脾气虚大鼠脑肠肽Ghrelin、VIP、CCK,及其受体的表达水平,发挥其外周和中枢效应从能量代谢角度对大鼠的脾气虚证起到调控作用。2.电针“足三里”穴可以调节脾气虚大鼠肌肉组织内NRF1及NRF2基因及蛋白的异常表达,参与线粒体能量代谢的调控作用进而改善脾气虚证。
【学位单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R245
【部分图文】：

基于脑肠肽和核呼吸因子 NRF1、NRF2 研究电针对脾气虚模型大鼠的调控机制实验结果各组大鼠一般状态观察大鼠始终体格健壮、毛色光滑润泽、反应灵敏；其余 3 组大鼠欲不振（食量减少）、体重减轻，15 日后表现出嗜睡扎堆、反槁无华，形体明显瘦削等症状。符合全国中西医结合虚证与于 1986 年制定的脾气虚证的宏观诊断标准。干预处理 7 日后，足三里组大鼠进食量逐渐增多、嗜睡减轻，穴组与电针干预前相比，一般状态未见明显改善。造模前、大鼠体重及抓力变化情况见图 1，表 2，图 2。

图 2 各组大鼠抓力变化情况（g）组织 Ghrelin、VIP、CCK 蛋白含量比较示：与正常组相比，脾气虚组和非经非穴组大鼠小肠组 含量升高（P﹤0.05）；与脾气虚组相比，足三里组 G降低（P﹤0.05），非经非穴组未见显著性差异（P﹥0大鼠小肠组织 Ghrelin、VIP、CCK 蛋白含量（pg/mL）样本数（n） Ghrelin VIP 10 291.74±55.28 46.62±5.42 10 164.37±19.34▲17.26±17.56▲10 252.44±24.57●56.36±5.74●10 185.27±34.77▲28.94±7.32▲比，▲代表 P﹤0.05；与脾气虚组相比，●代表 P﹤0.05

图 2 各组大鼠抓力变化情况（g）小肠组织 Ghrelin、VIP、CCK 蛋白含量比较果显示：与正常组相比，脾气虚组和非经非穴组大鼠小肠组织CCK 含量升高（P﹤0.05）；与脾气虚组相比，足三里组 Ghre 含量降低（P﹤0.05），非经非穴组未见显著性差异（P﹥0.05）各组大鼠小肠组织 Ghrelin、VIP、CCK 蛋白含量（pg/mL）（ 样本数（n） Ghrelin VIP 10 291.74±55.28 46.62±5.42 1 10 164.37±19.34▲17.26±17.56▲14 10 252.44±24.57●56.36±5.74●10 10 185.27±34.77▲28.94±7.32▲14组相比，▲代表 P﹤0.05；与脾气虚组相比，●代表 P﹤0.05。
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本文编号：2881942