从Akt-mTOR信号通路研究黄芪菟箭合剂对糖尿病大鼠的肾脏保护机制

发布时间：2017-09-22 09:10

  本文关键词：从Akt-mTOR信号通路研究黄芪菟箭合剂对糖尿病大鼠的肾脏保护机制

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【摘要】：研究背景：糖尿病肾病(Diabetes nephropathy, DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,也是糖尿病的主要致死原因。在发达国家糖尿病肾病是终末期肾脏疾病(End-stage renal failure,ESRD)的主要原因。目前我国DN患者在我国透析人数中已占据第二位,仅次于肾小球肾炎。糖尿病肾病极大的影响了患者的生存质量,并带来了沉重的经济负担。因而如何防止糖尿病的发生发展已成为当前急迫而重要的课题。肾小球足细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)活性的异常升高是糖尿病肾病发生蛋白尿的关键机制之一。在哺乳动物中,mTOR以雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)和雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)两种形式存在。mTORC1功能是主要促进合成代谢、调控细胞生长和增殖。雷帕霉素特异性抑制mTORC1可以防止糖尿病肾病发生发展,但过度抑制足细胞mTOR反而会造成足细胞的损伤,因而雷帕霉素可能会因为其毒副作用难以应用于临床治疗糖尿病肾病。我们既往的研究发现中药菟箭合剂具有减少糖尿病大鼠蛋白尿,减轻糖尿病肾病病理改变的作用,并有抑制肾小球系膜细胞蛋白激酶B(protein kinase B, PKB,也称为Akt)磷酸化的作用。本研究就是基于以往的科研工作,开展中医药对糖尿病大鼠肾脏保护作用的深层次研究。目的：观察中药黄芪菟箭合剂对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响,从而探讨黄芪菟箭合剂对糖尿病大鼠肾脏保护作用是否与调节这一信号通路有关,同时观察中药是否可以减轻雷帕霉素的毒副作用。方法：60只清洁级SD大鼠,随机分为正常对照组10只(CON组)与糖尿病组50只。糖尿病组大鼠禁食12小时候后予2%链脲佐菌素(STZ 65mg/Kg,临用前溶于PH4.2枸橼酸盐缓冲液)一次性腹腔注射,CON组大鼠予等体积枸橼酸缓冲液腹腔注射。72小时后,尾静脉取血测血糖,以血糖至16.7mmol/L,为造模成功。将稳定成模的42只糖尿病大鼠按体重随机分为四组：糖尿病对照组(DM组,n=10),雷帕霉素干预组(RAPA组,n=11)、黄芪菟箭合剂干预组(CM组,n=10)、雷帕霉素联合黄芪菟箭合剂干预组(RAPA+CM组,n=11)。糖尿病模型成功4周后开始干预治疗,RAPA组：按0.5mg/kg/qod腹膜内注射雷帕霉素；CM组：按lOg/kg/d灌胃黄芪菟箭合剂；RAPA+CM组：lOg/kg/d灌胃黄芪菟箭合剂并按0.5mg/kg/qod腹膜内注射雷帕霉素。干预治疗12周后,置代谢笼留12小时留取尿标本,取血,检测不同处理因素对大鼠血清肌酐、尿素氮及尿白蛋白排泄率(微量白蛋白肌酐比值,ACR)的影响,取大鼠肾皮质做常规病理切片,观察各组大鼠的肾脏病理变化；应用免疫组化方法检测ZO-1、nephrin、fibronectin等相关蛋白的表达；应用Westrn-blot检测磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化Pten、磷酸化$6K1的蛋白表达；应用RT-PCR检测Akt、Pten、S6K1的mRNA表达。结果：1黄芪菟箭合剂与雷帕霉素对糖尿病大鼠一般状况的影响：治疗12周后DM组大鼠血糖显著高于CON组,CM组血糖较DM组明显降低,RAPA组、RAPA+CM组血糖水平较DM组大鼠无明显差异,RAPA、RAPA+CM组大鼠体重显著低于DM组,而CM组大鼠体重与DM组无明显差异；RAPA组大鼠死亡率显著高于DM组、CM组和RAPA+CM组,CM组、RAPA+CM组死亡率与DM组无明显差异。以上结果说明黄芪菟箭合剂与雷帕霉素都可以有效的降低糖尿病大鼠的尿微量白蛋白排泄率,说明黄芪菟箭合剂与雷帕霉素对糖尿病大鼠微量白蛋白尿的治疗有效；雷帕霉素治疗组大鼠体重明显降低,死亡率明显升高,提示雷帕霉素有明显的毒副作用；中药与雷帕霉素联合应用可以减少大鼠死亡率。2黄芪菟箭合剂与雷帕霉素对糖尿病大鼠肾脏病理、细胞外基质、足细胞结构的影响：DM组大鼠较CON组大鼠肾小球体积增大,RAPA组、CM组、RAPA+CM组肾小球肥大情况较DM组明显减轻；CON组仅个别肾小球内有少量FN阳性染色,DM组大鼠肾小球内可见显著的FN阳性染色,其他三组治疗组FN阳性表达均显著低于DM组；DM组大鼠Z0-1、nephrin肾小球阳性染显著低于CON组,其他三组治疗组ZO-1、nephrin日性表达显著高于DM组；说明黄芪菟箭合剂与雷帕霉素均有减轻DN大鼠肾脏病理改变、肾小球细胞外基质沉积,维持足细胞结构完整性的作用。3本研究涉及的相关蛋白及相关蛋白mRNA的表达情况。DM组Pten蛋白表达较CON组显著降低,CM组、RAPA+CM组能显著提高肾组织Pten的表达,但RAPA组肾组织Pten表达与DM组无统计学差异；DM组磷酸化$6K1蛋白表达、S6K1mRNA表达显著高于CON组,RAPA组、CM组.RAPA+CM组中磷酸化$6K1蛋白表达、S6K1mRNA表达较DM组显著降低；DM组磷酸化Akt (Thr308)蛋白含量、AktmRNA表达较CON组显著增加,CM组、APA+CM组能显著降低磷酸化Akt(Thr308)蛋白含量和AktmRNA表达,但RAPA组磷酸化Akt (Thr308)蛋白含量和AktmRNA表达较DM组无明显差异。结论：雷帕霉素和黄芪菟箭合剂都可以有效地保护STZ诱导的糖尿病大鼠足细胞的完整性、保护肾脏结构、减少尿微量白蛋白排泄率。雷帕霉素单一的抑制mTORC1的激活造成严重的毒副作用。黄芪菟箭合剂在降低血糖的同时,显示出全面调控PI3K/Akt/mTOR信号通路的效应,同时能够减少雷帕霉素的毒性,显示出其临床潜在的运用价值。
【关键词】：糖尿病肾病 肾小球足细胞 雷帕霉素靶蛋白 中药
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文缩略词表(Abbreviationand acronyms)11-12
• 综述12-17
• 前言17-19
• 材料和方法19-29
• 1 实验材料19-21
• 2 实验方法21-29
• 实验结果29-40
• 1 一般情况29-30
• 2 生化指标比较30-31
• 3 肾脏普通病理观察结果31-33
• 4 肾皮质FN、ZO-1、nephrin免疫组化染色情况33-35
• 5 Westernblot检测各组大鼠肾磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化Pten、磷酸化S6K1蛋白表达35-36
• 6 RT-PCR检测各组大鼠肾Akt(308)、Pten、S6K1mRNA表达36-40
• 讨论40-46
• 1 关于糖尿病大鼠模型的建立40
• 2 足细胞损伤与PI3K/Akt/mTOR信号通路40-42
• 3 关于雷帕霉素的作用42-43
• 4 关于黄芪菟箭合剂的作用43-45
• 5 本研究的不足和展望45-46
• 结论46-47
• 参考文献47-53
• 致谢53-54
• 个人简历54

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本文编号：899961