膦酸交联高分子包埋理念构建电化学生物传感仪

第1章绪论

1.1电化学生物传感器
经过几十年的研究，电化学传感器在参比电极、电位传感器、伏安传感器、电化学生物传感器以及电化学气体传感器等方面取得了巨大的进步[1，2]。其中，电化学生物传感器具有成本低廉，操作简单，选择性专一，检测灵敏度高等优势，因而引起了研宄工作者的广泛关注。电化学生物传感器是由生物识别元件(电活性物种)和信号转换器件(基底电极)这两个基本结构单元组成的，通过各种物理或化学信号转换器件捕捉目标分子与识别元件之间反应所产生的电信号，实现目标分子的定量测定，那么，其关键步骤是识别元件的构建。对于目前而言，识别元件的构建仍然集中在电活性物种固定化方法的改进，从而来提高电化学生物传感器的灵敏度和稳定性，扩大其在临床诊断、环境检测、工业控制和生物分析等领域的应用[3-5]。
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1.2电化学生物传感器的类型
根据生物反应产生信息的物理或化学性质，信号转换器通常采用与之相匹配的电化学、光谱、热、压电以及表面声波等技术，由此衍生出电化学生物传感器、光生物传感器、半导体生物传感器、热生物传感器和压电晶体生物传感器等。其中，电化学生物传感器又可按被选生物化学受体的不同进行分类，主要有酶传感器、DNA传感器和免疫传感器。酵生物传感器是电化学生物传感器领域中研究最多也是最早的一类。在2006~2007年之间，酶生物传感器发展非常迅速。这段时间内大量的纳米材料被应用于电化学生物传感器的构建。例如，Namvakaki等人用二氧化桂(silica)和导电性碳纳米纤维材料(nanofiber)制备得到电化学生物传感器(图1.1),他们将酶包埋到聚赖氨酸为端基的桂胶表面，得到的酶生物传感器即使在苟刻条件(如高温)下也具有较好的活性。葡萄糖生物传感器能够用于糖尿病的控制，所以倍受关注随着糖尿病人数的不断增加，新型的葡萄糖传感器急需不断研发。例如，Fu等人[16]利用化学预氧化和电化学聚合方法(CPEM)在含有酶的溶液中聚合单体得到安培葡萄糖生物传感器。含有葡萄糖氧化酶(GOx)或碱性憐酸酶(ALP)的低聚物复合材料与聚(1,4-苯二硫酷)通过电化学共沉积在金电极表面，其制备过程如图1.2所示，得到的复合膜的酶负载量和活性都很高，且该法制得的葡萄糖传感器比用普通电解法制得的传感器灵敏度高。相比于传统的识别元件，适配体具有固有的选择性和亲和性等多种优点，己经被广泛用于新型传感器的设计。DNA传感器一般可分为两类：(1)传感器用于检测特定的DNA序列；（2)利用DNA片段传感器来检测非DNA分子(如小分子和蛋白质)。Lubin等人[21]研究了探针的长度和几何形状，以及氧化还原标记的位置对DNA电化学传感器的影响。通过不同长度的直链或芳经探针以及氧化还原位置的不同制备不同序列结构的传感器，，具体制备过程如图1.3所示。Wu等人[22]提出了一种电化学检测DNA和蛋白质的信号放大方法。目标分子在电极表面被捕获后，就会引发受控的自由基聚合反应。随着聚合物材料的链段长度不断增加，可为后续氨基二茂铁的偶合反应提供许多场所，反过来又能增加电化学信号的输出。DNA和卵清蛋白的检测限分别为15 pM和0.07 ng/mL。
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第2章膽酸诱导壳聚糖絮凝包埋蛋白质/酶用于电化学生物传感器的构建

2.1引言
蛋白质/酶的固定在生物科学和生物技术研究中至关重要[8"]。由于非共价包埋蛋白质/酶具有各种突出的优点，所以其对生物催化、生物传感器、生物电子器件和生物燃料电池的发展具有深远的影响。例如，像娃、铁、锅和锆这些选择性包埋材料呈现出化学惰性，亲水性和热稳定性，从而能有效防止蛋白质的变性。同时，非共价包埋不需要来自蛋白质/酶上的氨基或接基的共价作用，因此，几乎不会改变蛋白质/酶的空间构象。此外，非共价包埋在室温下即可进行，这有助于保持蛋白质/酶的生物活性。壳聚糖(CS,学名为聚氨基-2-脱氧-D-葡萄糖])，由于具有良好的生物相容性、廉价以及低毒性[87_91]等特点，因此可作为固定蛋白质/酶的优良基质。碳纳米管(CNTs)作为碳纳米材料的一员，具有特殊的物理、化学和机械性能，例如高电导率、高化学稳定性、大表面积及强抗腐烛性因此，CS-CNTs复合材料同时具有CS的生物相容性和CNTs的导电性，可广泛用于生物传感器和生物催化剂的构建到目前为止，pH诱导交联法[97，化学诱导交联法和溶液蒸发法[1。51常用于制备壳聚糖基生物传感器和生物催化装置。但是，天然壳聚糖只有在酸性溶液中是可溶的，这就限制了通过pH诱导交联法和溶液蒸发法来制备壳聚糖基生物装置的适用范围。虽然使用戊二酸共价交联的壳聚糖是不溶的，但是戊二酸和蛋白质/酵之间的共价交联过程会导致蛋白质/酶发生构象变化，甚至变性。
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2.2实验部分

2.2.1试剂
牛血红蛋白(Hb，M=64，500)购于Sigma公司，使用前未进一步纯化。多壁碳纳米管(MWCNTs，纯度>95%，比表面积：110 m2 g-i)购于成都有机化学试剂有限公司。乙二胺四亚甲基膦酸(EDTMP)购于山东泰和水处理有限公司，在使用前用无水乙醇重结晶两次。壳聚糖(CS，脱乙酸度约95 %, M=150，000)购于南通兴成生物制品厂。1.0 mg mL—i CS溶液制备：100 mg CS溶于100 mL 1 wt%W乙酸溶液。所得溶液过滤后用NaOH溶液调节其pH至5.0。过氧化氧(H2O2)溶液需现配，其浓度用KMn04标准溶液标定。醋酸-醋酸钠缓冲溶液(HAc-NaAc，0.1M, pH 5.0)由HAc和NaAc按一定比例配制而成。其它试剂均为分析纯，且未进一步纯化。
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第3章Fem-DETPA配合物在PAH功能化的多壁碳纳米管.....29
3.1引言 .....29
3.2实验部分..... 29
3.3结果与讨论..... 31
3.4本章小结.....   40
第4章一步电沉积法制备壳聚糖/膦酸铁(m)复合膜.....41
4.1引言 .....41
4.2实验部分 .....42
4.2.1 试剂..... 42
4.2.2 仪器.....   42
4.2.3 CS-Fe(notpH3)/Au 修饰电极的制备..... 42
4.3结果与讨论..... 42
4.3.1 CS-Fe(notpH3)复合膜的表征..... 42
4.3.2 CS-Fe(notpH3)/Au修饰电极的直接电化学..... 45
4.3.3 pH敏感的电催化性能..... 46
4.4本章小结..... 49
第5章结论..... 50

第4章一步电沉积法制备壳聚糖/膦酸铁(III)复合膜及其pH可控的电催化

4.1引言
近年来，各种物理/化学信号敏感的激励响应功能材料在药物缓释、废水处理、传感器、分子器件等诸多领域的潜在应用己引起广泛关注[172]79]。特别是，激励响应材料修饰电极可通过外部信号激励使电化学开关和界面氧化还原反应速率调控成为可能。事实已证明电催化的可控和信号诱导在信息储存、数据处理、信号传导和放大、电化学传感器及其他电子器件方面具有很大的潜在应用[180-190]0基于高分子膜切换/可调的电催化，其虽然不直接参与电子转移过程，但是影响活性物种从本体溶液到电极表面的传导过程，故已成功实现通过改变温度、电场、pH值、离子强度以及电位来控制电极的界面性质在各种外部激励切换/可调的电催化中，其中pH可控的电催化是研究最多的。一般来说，切换/可控电催化是通过将氧化还原探针(例如Fe(CN;)63-，Fc(C00H)2和RU(NH3)63+等）嵌入pH敏感的聚合物膜内从而实现的，这是一个聚合物膜中酸/碱的质子化/去质子化切换使其在带电和不带电状态之间跳跃的过程。例如，Hu等人己制备得到了多种聚合物基的层层自组装膜，其均显示出pH敏感渗透性，故可用作电活性探针，将其应用到控制电催化中但是，这些修饰电极往往在储存和运行过程中有一定量的氧化还原探针的泄漏，从而导致其稳定性和可切换次数不理想。因此，探究一种新型的具有高稳定性和重复性的刺激响应功能材料是非常有必要的。

结论

本论文的总体思路为利用有机膦酸的-PO3H2官能团交联高分子聚合物的-NH2官能团物理包埋电活性物种从而构建电化学生物传感器。相比于传统的固定化方法(吸附法、共价键合法和交联法)，本文采用的物理包埋法的优势突显在制得传感器具有更高的活性回收率以及更好的稳定性。本论文的主要创新结果如下：
1.利用EDTMP中的-PO3H2基团与CS的-NH2基团之间的相互作用来诱导CS在低pH值条件下絮凝从而包埋Hb。包埋的Hb能够实现其直接电子转移，且对H2O2还原显示出良好的电催化性能。
2.利用HsDETPA为配体合成了含有未配位-COOH官能团的电化学活性Fe°DETPA配合物。利用EDTMP中的-PO3H2基团交联PAH的-Nlfc基团从而诱导PAH絮凝来物理包埋Fe°-DETPA配合物，Fe-DETPA配合物中未配位-COOH官能团与PAH中-NH2官能团间的静电相互作用可实现Fe-DETPA配合物在PAH-MWCNTs纳米复合物中的有效固定。固定的Fe-DETPA配合物能够实现直接电子转移，且对H2O2呈现出良好的电催化活性，可用于对H2O2的电化学检测。
3.合成了含有未配位-PO3H2官能团的Fe(iiotpH3)配合物，FenotpH3)配合物自身即可导致CS絮凝，从而实现Fe(notpH3)配合物在CS中的包埋。利用一步电沉积法即可制得具有三维多孔结构的CS-Fe(notpH3)复合膜。复合膜内Fe(notpH3)配合物能够实现其直接电子转移，且对H2O2还原显示出优良的电催化活性，可用于对H2O2的电化学检测。此外，在pH 3.5-4.1之间，Fe(notpH3)的式电位值随溶液pH值改变而急剧跳跃、利用此特性可制备一个基于H2O2还原的电化学开关。
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参考文献（略）