3个罂粟SSR基因座荧光复合扩增体系的构建及应用

发布时间：2017-04-01 09:14

  本文关键词：3个罂粟SSR基因座荧光复合扩增体系的构建及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:罂粟(Papaver somniferum L)属—年生草本植物,是世界三大毒品原植物之一。由于其提取物能制成鸦片类毒品(包括鸦片、吗啡、海洛因等),具有强烈成瘾性和毒性,给个人和社会造成严重危害,因此罂粟的非法种植买卖以及在食品中添加都被国家法律明令禁止(全国多地现罂粟壳入食品调料事件),然而在高额的利润驱使下,世界范围内违禁种植罂粟的活动仍旧猖獗,手段更加隐蔽和高明,由于罂粟的花瓣、颜色及果实与观赏植物虞美人(丽春花果)等近缘种植物非常相似,增加了罂粟鉴别的困难,给禁毒铲毒工作带来挑战。在法庭科学中,传统检验主要是通过生物形态学和化学的方法,这些方法虽然适用范围比较广,但不能对罂粟幼苗、种籽及植株物种来源进行明确的定性和推断,为了更好的达到罂粟种属鉴定的目的,需要尝试寻求新的更好的方法来解决这一问题。微卫星STR是由1~6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列,广泛分布于人类、动物和植物的基因组中,是人类DNA分析中最常用的分子标记,植物的STR标记称SSR标记,目前多应用于植物遗传多样性分析、种属鉴定、个体识别、遗传图谱构建等方面。罂粟由于获取受限,国内外对其DNA分子生物学遗传标记的研究不多。本实验研究旨在开发并构建罂粟3个SSR基因座的荧光复合扩增体系,运用该体系准确将罂粟与其近缘种植物进行区分,为公安机关办理涉毒案件中罂粟的种属鉴别提供简便、快速、准确的方法。方法:1)分别采用公安部物证鉴定中心实验室优化的硅珠提取法和商业试剂盒两种植物DNA提取方法提取已知罂粟植物样本的DNA;2)通过反复扩增实验对本实验室前期自行设计的多条EST-SSR和基因组SSR引物进行筛选;3)构建包含3个SSR基因座的复合扩增体系,通过调整酶浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、退火温度、循环次数对复合扩增体系进行优化;4)对该荧光复合扩增体系的灵敏度、组织同一性、种属特异性、可重复性进行验证;5)将该复合扩增体系应用于实际案例,通过对5个公安系统办理的涉毒案件中疑似罂粟样本进行检测,进一步验证该体系的有效性。结果:1)采用两种植物DNA提取方法提取了罂粟DNA,从自行设计的引物中筛选出2条引物P12、P13,开发了2个罂粟特异性SSR位点,结合此前已有的1个SSR位点,成功构建了包含3个SSR位点的荧光复合扩增检验体系;2)在种属特异性研究中,用该复合扩增体系分别对罂粟、白屈菜、东方罂粟、虞美人、冰岛虞美人、大麻以及其他普通植物等10余种植物样本进行检测,结果显示,罂粟的扩增产物含有大小分别243bp(±1bp)、183bp(±1bp)、211bp(±1bp)和223bp(±1bp)的基因片段;东方罂粟的扩增产物含有大小为205bp(±1bp)的基因片段;虞美人和冰岛虞美人的扩增产物中含有大小为208bp(±1bp)的基因片段;大麻、烟草以及其他普通植物样本未出现任何扩增产物;3)在灵敏度检测中,该体系的最小检出量为0.1ng/u L;4)用该荧光复合扩增体系对不同来源的5个实际案件中疑似罂粟样本进行检测,成功检验出罂粟,结果与原鉴定结论一致,证实可应用于法医实践。结论:本研究成功构建了包含3个SSR位点的罂粟荧光复合扩增检验体系,该体系易于优化、灵敏度高、结果稳定,能将罂粟与其近缘种植物、大麻、其他普通植物有效区分,实现了在分子生物学水平上的特异性检测,为毒品原植物罂粟的检验鉴别提供了准确可靠的新方法,是传统生物形态学及化学检验方法的丰富和补充,对于公安机关查处罂粟非法种植,打击毒品犯罪有重大意义。
【关键词】：SSR位点 复合扩增 罂粟 毒品原植物
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-17
• 结果17-21
• 附图21-46
• 附表46-47
• 讨论47-53
• 结论53-54
• 参考文献54-56
• 附录56-58
• 综述 毒品原植物DNA分子遗传学标记研究58-71
• 参考文献67-71
• 致谢71-72
• 个人简历72

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