hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠用于混合细胞中精子的分离与法医学鉴定

发布时间：2021-04-18 23:34

　　hLCN6 （Human lipocalin 6）是附睾特异性分泌蛋白,它能与精子结合,对精子的成熟发挥着重要作用。为了探究应用抗hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠技术分离混合细胞中精子的可行性,建立混合斑中精子细胞分离的新方法,制备了不同比例的精子-上皮细胞混合悬液及混合斑样本,以生物素标记的hLCN6单克隆抗体孵育样品,再用亲和素包被的免疫磁珠捕获分离精子细胞,提取精子DNA进行PCR-STR （Short tandem repeat）分型,同时以差异裂解法提取精子,比较两者的差异。经ELISA检测,hLCN6单克隆抗体与抗原的亲和力解离常数（Kd）为3.47×10^–9 mol/L。免疫印迹和免疫荧光结果显示,hLCN6在精子中可检测到,主要定位于精子头部的顶体后区域,但不能在上皮细胞中检测到。hLCN6抗体偶联的免疫磁珠复合物能够实现精子细胞的捕获和分离,显微镜观察显示免疫磁珠能够与精子头部特异性结合。对精子个数为10³/mL的混合悬液,STR分型成功率（正确分型13个以上,RFU>200）为90%。当精子数量≥10⁴

【文章来源】：生物工程学报. 2019,35(01)北大核心CSCD

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抗hLCN6mAb亲和力测定Fig.1Affinityassayofanti-hLCN6mAb.

ISSN1000-3061CN11-1998/Q生物工程学报ChinJBiotechhttp://journals.im.ac.cn/cjbcn154图1抗hLCN6mAb亲和力测定Fig.1Affinityassayofanti-hLCN6mAb.图2Westernblotting检测hLCN6在精子及口腔上皮细胞的表达Fig.2WesternblottinganalysisofhLCN6expressioninspermatozoaandbuccalepithelialcells.1:buccalepithelialcells;2:spermatozoa.2.3hLCN6的精细胞定位用纯化的抗hLCN6mAb对精子进行免疫荧光染色，结果显示，在精子头部的顶体后区域出现明显的荧光信号(图3)，证明hLCN6蛋白主要分布在精子头部，这与之前文献报道一致。与hLCN6蛋白结合的精子阳性率为(90±5)%(n=6)。而对照抗体染色的精细胞头部为阴性。2.4Anti-hLCN6IMBs捕获精子情况将生物素标记的抗hLCN6mAb包被IMBs，与细胞混合悬液进行孵育，充分洗涤后将样品制备成涂片进行显微观察。显微镜下见精子结构完整，每个精子可结合多个磁珠，主要结合在精子头部(图4)。镜下未检测到口腔上皮细胞。图3抗hLCN6mAb的免疫荧光染色分析Fig.3Immunofluorescenceanalysisofanti-hLCN6mAbstaininginspermcells.(A)Immunofluorescentstainingofspermatozoawithanti-hLCN6mAb.(B)ControlimmunofluorescentstainingofspermatozoawithnormalmouseIgG.(C,D)Spermcellsobservedunderalightmicroscope.图4显微镜观察anti-hLCN6IMBs捕获精子情况Fig.4Opticalmicroscopyimageforintact(A)andtail-lostspermcell(B)capturedbyanti-hLCN6IMBs(400×).2.5IMB法和差异裂解法分离精子DNA分型检测情况为了检测anti-hLCN6IMBs分离精子的效率和灵敏度，制备了

ISSN1000-3061CN11-1998/Q生物工程学报ChinJBiotechhttp://journals.im.ac.cn/cjbcn154图1抗hLCN6mAb亲和力测定Fig.1Affinityassayofanti-hLCN6mAb.图2Westernblotting检测hLCN6在精子及口腔上皮细胞的表达Fig.2WesternblottinganalysisofhLCN6expressioninspermatozoaandbuccalepithelialcells.1:buccalepithelialcells;2:spermatozoa.2.3hLCN6的精细胞定位用纯化的抗hLCN6mAb对精子进行免疫荧光染色，结果显示，在精子头部的顶体后区域出现明显的荧光信号(图3)，证明hLCN6蛋白主要分布在精子头部，这与之前文献报道一致。与hLCN6蛋白结合的精子阳性率为(90±5)%(n=6)。而对照抗体染色的精细胞头部为阴性。2.4Anti-hLCN6IMBs捕获精子情况将生物素标记的抗hLCN6mAb包被IMBs，与细胞混合悬液进行孵育，充分洗涤后将样品制备成涂片进行显微观察。显微镜下见精子结构完整，每个精子可结合多个磁珠，主要结合在精子头部(图4)。镜下未检测到口腔上皮细胞。图3抗hLCN6mAb的免疫荧光染色分析Fig.3Immunofluorescenceanalysisofanti-hLCN6mAbstaininginspermcells.(A)Immunofluorescentstainingofspermatozoawithanti-hLCN6mAb.(B)ControlimmunofluorescentstainingofspermatozoawithnormalmouseIgG.(C,D)Spermcellsobservedunderalightmicroscope.图4显微镜观察anti-hLCN6IMBs捕获精子情况Fig.4Opticalmicroscopyimageforintact(A)andtail-lostspermcell(B)capturedbyanti-hLCN6IMBs(400×).2.5IMB法和差异裂解法分离精子DNA分型检测情况为了检测anti-hLCN6IMBs分离精子的效率和灵敏度，制备了

【参考文献】：
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本文编号：3146378