基因区与基因间区五条靶序列DNA甲基化在甄别同卵双生个体中的研究

发布时间：2017-07-30 22:07

  本文关键词：基因区与基因间区五条靶序列DNA甲基化在甄别同卵双生个体中的研究

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【摘要】：目的：由于同卵双胞胎（monozygotic twins, MZ）是由同一个受精卵发育而来，拥有相同或高度相似的DNA序列，采用目前使用的个体识别技术，如短串联重复（short tandem repeat, STR）分型技术、单核苷酸多态性（single nucleotide polymophism, SNP）分型技术，mtDNA分型技术等，均不能对其进行区分，这给涉及MZ的案件侦破带来极大困难和阻力。表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰，其中DNA甲基化是最主要的一种表观遗传修饰。近年来研究发现MZ个体的DNA甲基化存在差异，且本课题前期通过对1对新生儿MZ的全基因组甲基化谱的检测，发现在基因区和基因间区共有2205条DNA甲基化差异序列，并筛选出113条序列作为后续分析的候选位点。 本研究将从中进一步筛选一些序列，利用焦磷酸测序测序技术对大样本双生子进行DNA甲基化定量分析，探讨各序列甲基化能否鉴别MZ，评估其鉴别能力，并比较基因区和基因间区DNA甲基化鉴别MZ能力的大小，旨在为从遗传学角度解决鉴别MZ不同个体的难题提供基础数据，为建立可行的解决方案提供有价值的参考。 方法：应用Qiagen公司的QIAamp DNABlood kit提取血液样本的DNA,应用漱口水提取试剂盒（泰州泰朗生物科技服务有限公司）提取漱口水的全基因组DNA。利用Goldeneye DNA身份鉴定系统的BASIC试剂盒检测双生子DNA样本的STR分型，以明确每对双生子样本的同异卵情况。应用ZYMO公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit对基因组DNA进行重亚硫酸氢盐转化，转化后的DNA做为模板，分别扩增GS1、 GS2、GS3、IGS1、IGS2五条靶序列。对扩增产物进行单链纯化，然后进行焦磷酸测序，获得五条序列20个CpG位点甲基化水平的定量数据。应用Spearman相关检验、pearson相关分析、t检验、χ2检验、秩和检验等方法进行统计学分析。 结果： 15条靶序列的特征 GS1(Genebank Accesion number: XM_006726188)位于跨膜通道样蛋白4（transmembrane channel-like4，TMC4）的外显子区，扩增片段为85bp，可检测6个CpG位点；GS2(Genebank Accesion number: NM_001159387)位于beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase2(B4GALNT2)的外显子区，扩增片段为105bp，可检测2个CpG位点；GS3(Genebank Accesionnumber: NM_001256358)位于酪氨酸蛋白激酶6（protein tyrosine kinase6,PTK6)的外显子区，扩增片段为129bp，可检测5个CpG位点。 IGS1和IGS2均位于3号染色体(Genebank Accesion number:NC_000003.12)的基因间区，IGS1扩增片段为139bp，可检测4个CpG位点； IGS2扩增片段为164bp，可检测3个CpG位点。 25条靶序列的平均DNA甲基化水平及组织差异性分析 在所调查的352个血液样本中，GS1、GS2、GS3、IGS1、IGS2序列的平均甲基化水平为88%、89%、92%、85%、82%。 血液样本中GS1、GS3序列11个CpG位点的平均甲基化水平分别为92%、83%、74%、97%、93%、89%、93%、98%、90%、90%、89%，但在126个漱口水样本中的平均甲基化水平分别为66%、65%、57%、68%、66%、62%、89%、96%、86%、87%、88%明显低于血液样本。其中102名个体同时包括血液样本和漱口水样本，对该102名个体血液与漱口水样本的甲基化水平进行配对t检验，发现GS1序列和GS3序列DNA甲基化水平在同一个体漱口水与血液样本中也存在明显差异，血液的甲基化程度显著高于漱口水的甲基化程度。 相关系数矩阵显示，在每一个序列内部，各CpG位点之间甲基化程度的表现为一定的相关性。 3双生子之间甲基化差异分析 以焦磷酸测序仪灵敏度5%为标准，我们设定，若双生子之间甲基化水平差值大于5%，则被认为有差异，小于或等于5%的视为无差异。 3.1血液样本各序列双生子间差异分析 GS1、GS2、GS3、IGS1、IGS2序列MZ之间甲基化水平有差异的分别有38对、0对、18对、31对、57对，DZ之间甲基化水平有差异的分别有21对、0对、5对、23对、12对。5条序列累积能够区分93对MZ和39对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的77.50%及67.24%，表明在血液样本中5条序列20个CpG位点区分MZ的累积鉴别能力为77.50%，，区分DZ的累积鉴别能力为67.24%。 对各序列鉴别MZ与DZ的能力进行χ2检验比较分析，发现基因区GS1及GS3鉴别MZ与DZ的能力无差异，二个序列联合起来计算，鉴别MZ与DZ的能力也无明显差异；但基因间区IGS1鉴别MZ能力小于DZ，IGS2鉴别MZ的能力大于DZ，二者联合起来，差异无统计学意义。 此外，我们分析了基因区和基因间区序列鉴别MZ能力是否存在差异。结果显示，基因区的3条序列13个CpG位点能够区分50对MZ及23对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的41.67%及39.66%。而基因间区2条序列7个CpG位点能够区分73对MZ及29对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的60.83%及50.00%。经χ2检验，基因间区序列鉴别MZ的能力明显高于基因区序列。 3.2漱口水样本各序列双生子间差异分析 漱口水样本GS1、GS3序列MZ之间甲基化水平有差异的分别有40对、15对，DZ之间甲基化水平有差异的分别有10对、1对。2条序列累积能够区分42对MZ和10对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的84.00%及76.92%，表明在漱口水样本中2条序列11个CpG位点区分MZ的累积鉴别能力84.00%，区分DZ的累积鉴别能力为76.92%。经χ2检验，漱口水样本的鉴别能力明显高于对应序列血液样本的鉴别能力。 3.3双生子之间甲基化差别与年龄的相关性分析 为探讨双生子间甲基化的差别是否随年龄增加而增大，我们分析了二者之间的相关性。结果表明，IGS1序列、IGS2序列在MZ之间的DNA甲基化差异与年龄呈较弱的负相关，相关系数分别为-0.276、-0.229，表现为，随着年龄增大，MZ之间的甲基化差异呈现减小的趋势。其余序列甲基化在MZ之间的差异与年龄均无明显相关性。 4年龄、性别、民族、吸烟与甲基化的相关性 4.1年龄对5条靶序列甲基化的影响 Spearman秩相关分析结果表明，血液样本中GS1、GS3、IGS1、IGS2四条靶序列及漱口水样本中GS3序列的甲基化程度均与年龄呈弱相关，相关系数分别为0.223、-0.214、-0.376、-0.202及0.241。 我们按照10岁的年龄段将样本分为5个年龄组：0-10岁、11-20岁、21-30岁、31-40岁、41-50岁及50岁。比较各年龄组间甲基化程度的差异，发现血液样本的所有5条靶序列各年龄组间甲基化程度存在显著差异，漱口水样本GS3序列甲基化程度在各年龄组间存在差异，只有漱口水样本GS1序列甲基化水平在各年龄组无显著差异。差异主要表现在低年龄组（0-10岁组）与高年龄组（31-40、41-50、＞50岁组）间。 4.2性别对5条靶序列甲基化的影响 Spearman秩相关分析结果表明，性别因素与血液样本中5条靶序列及漱口水样本中2条靶序列的甲基化程度均无明显相关性。不同性别间的甲基化水平比较结果也表明，在所检测的所有序列中，甲基化程度在不同性别之间无显著差异。 4.3民族对5条靶序列甲基化的影响 样本志愿者来自六个民族：汉族、哈尼族、拉祜族、壮族、回族及彝族，因后四个民族样本较少，合并为一组。Spearman秩相关分析结果表明，只有血液样本中GS2序列甲基化程度与民族具有较弱的相关性，r=0.243，其余各序列甲基化程度均与民族无明显相关性。在血液样本GS1序列的CpG3位点、GS2序列的CpG1位点、GS3序列的CpG5位点，汉族与其他民族甲基化水平有差异。GS2序列的CpGmean汉族与其他民族甲基化水平也表现出显著差异。 4.4吸烟对5条靶序列甲基化的影响 Spearman秩相关分析结果表明，只有血液样本GS3序列甲基化程度与吸烟呈弱相关，其余序列甲基化程度均与吸烟无显著相关性。血液样本GS3序列的CpG5、IGS1序列的CpG2位点、IGS2序列的CpG1位点，吸烟与不吸烟者甲基化水平有明显差异，GS3序列的CpGmean吸烟与不吸烟者甲基化水平也表现出显著差异。漱口水样本GS3序列的CpG4位点吸烟与不吸烟者也存在显著差异。 结论: 1）本研究选用的5条靶序列DNA甲基化鉴别MZ的累积效能为77.5%，除GS2外，其余4条靶序列均有一定的鉴别能力，可作为候选序列。基因间区两条序列鉴别MZ能力明显高于基因区的三条序列，提示我们尽量选择基因间区序列作为候选序列，以提高甄别效能。同一序列漱口水样本鉴别MZ能力高于血液样本，说明漱口水样本的甲基化差异程度大于血液样本，甄别MZ的价值优于血液样本。基因间区两条序列DNA甲基化在MZ双生子个体间的差异程度随年龄增加呈现较弱的下降趋势，原因有待进一步研究。 2）5条靶序列中除GS2外的DNA甲基化程度均与年龄呈一定的相关性，且不同年龄组间存在显著差异，表明年龄是影响DNA甲基化的一个重要因素。5条序列中，只有GS2(B4GALNT2)的外显子甲基化与民族具有相关性，汉族与哈尼族和其他民族DNA甲基化表现出明显差异，表明该基因在不同民族间的甲基化程度不同，可能成为种族鉴别的遗传标记。5条序列中，只有GS3(PTK6)的外显子甲基化与吸烟有关，表明吸烟可能影响该基因的甲基化修饰及表达调控。 3）GS1和GS3两条序列DNA甲基化表现出明显的组织差异性，血液样本的甲基化程度明显高于漱口水样本，提示我们在实际应用中，一定要采样相同的组织样本进行比对。
【关键词】：同卵双生子 DNA甲基化 基因区序列 基因间区序列 重亚硫酸氢盐转化 焦磷酸测序
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：D919.4
【目录】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-16
• 英文缩写16-17
• 前言17-18
• 材料与方法18-23
• 结果23-28
• 附图28-48
• 附表48-55
• 讨论55-60
• 结论60-61
• 参考文献61-64
• 综述 法医 DNA 甲基化分型：机遇与挑战64-83
• 参考文献75-83
• 致谢83-84
• 个人简历84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 尹慧;黄代新;翟仙敦;杨庆恩;;HPLC法检测人外周血5-~mC含量及其与年龄相关性研究[J];中国法医学杂志;2007年01期

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中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 徐洁;LINE-1 DNA甲基化：鉴别同卵双生个体的潜在遗传标记[D];河北医科大学;2013年

本文编号：596243