红缘拟层孔菌氯仿提取物对人结直肠癌SW-480细胞的增殖和迁移抑制及其作用机制研究

发布时间：2017-10-23 22:16

  本文关键词：红缘拟层孔菌氯仿提取物对人结直肠癌SW-480细胞的增殖和迁移抑制及其作用机制研究

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【摘要】：研究背景及目的红缘拟层孔菌[Fomitopsis pinicola(Sw.:Fr.)P. Karst]为世界性分布的木腐真菌,因其具有一定药用价值在西方国家以及中国、日本、韩国等亚洲国家均有广泛应用。例如,在西方国家,红缘拟层孔菌主要用于治疗头晕、恶心和肝病等；而在中国,其主要用于祛风除湿、解热、强心、补肺益肾、和胃健脾、安神定志、扶正培本、滋补强壮。现代药理学研究表明,红缘拟层孔菌对脑溢血、心脏病、糖尿病、贫血、肾炎、支气管炎等病也有较好疗效。近年来,红缘拟层孔菌醇提物的抗肿瘤研究也屡见报道。因此,本论文以红缘拟层孔菌中细胞毒性较强的氯仿提取物(FPKc)为主要研究对象,分析了其中的化学成分,评价了细胞水平和整体动物水平的抗肿瘤效果,并对FPKc杀伤肿瘤细胞的作用机制进行初步研究。旨在为具有自主知识产权的抗癌新药研发提供理论依据,同时为红缘拟层孔菌应用于结肠癌的临床治疗提供科学参考。研究方法及结果首先,建立高效液相色谱法,以茯苓酸,麦角甾醇和去氢齿孔酸标准品作为对照,定性定量分析红缘拟层孔菌氯仿提取物(FPKc)的化学成分。结果显示,麦角甾醇,茯苓酸和去氢齿孔酸在FPKc的含量分别为10.5%,3.56%和0.25%。此外,HPLC分析显示,经FPKc作用后的SW-480细胞裂解液中有麦角甾醇存在。其次,MTT实验检测了FPKc对三种结直肠癌细胞的毒效应,结果表明,FPKc能不同程度抑制体外培养的结直肠癌SW-480、SW-620、Caco-2细胞的增殖,并呈现时间、剂量依赖性；不同的结直肠癌细胞对FPKc的敏感程度也具有差异性,药物作用48 h后,SW-480和SW-620细胞的半数抑制率(IC50)分别为190.28 μg/ml和143.26 μg/ml,而药物作用72 h后,FPKc对Caco-2细胞才表现出明显的杀伤作用。FPKc杀伤结肠癌细胞的作用机制研究表明,其能够诱导SW-480细胞发生凋亡,HO染色后,荧光显微镜下能够观察到明显的核凝集现象；流式细胞仪分析结果显示：FPKc能够对SW-480细胞的DNA造成明显损伤,并引起细胞G1期阻滞；Western blotting结果显示,FPKc能够明显活化Caspase-3和PARP,下调Bcl-2的表达；此外,FPKc能够引起细胞内谷胱甘肽含量的下降,进而引起胞内活性氧的积累,最终导致细胞凋亡。同步的研究结果也提示,FPKc中相对含量较高的ES同样能够诱导SW-480细胞发生凋亡。接下来,通过损伤修复和Transwell实验研究了FPKc对SW-480细胞迁移能力的影响,结果显示,高浓度FPKc对SW-480细胞的迁移抑制率高达70%。借助免疫荧光法发现FPKc能够显著抑制SW-480细胞胞外基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。同步的研究结果也提示,FPKc中相对含量较高的ES同样能够下调MMP-2和MMP-9的表达,并抑制SW-480细胞的迁移。最后,利用腹腔注射和皮下接种构建S180荷瘤小鼠模型,与对照组相比,FPKc能够显著抑制S180实体瘤体积,延长腹水瘤小鼠的存活期,并明显改善荷瘤小鼠的生存质量。结论FPKc含有麦角甾醇,茯苓酸和去氢齿孔酸,其中麦角甾醇能够被人结肠癌SW-480细胞摄取,可能为FPKc发挥抗肿瘤作用的主要成分。体外实验证明,FPKc损伤细胞DNA,引起细胞周期阻滞于G1期,进而诱导细胞发生凋亡,并且胞内活性氧的过度积累可能是导致细胞发生凋亡的重要诱因；FPKc还能够通过下调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,抑制SW-480细胞的迁移；同步实验提示,麦角甾醇亦可抑制结肠癌细胞的增殖,其抗肿瘤作用机制与FPKc相似,由此佐证麦角甾醇可能是FPKc主要的抗肿瘤活性成分之一。在体实验进一步表明FPKc能够显著抑制S180荷瘤小鼠体内肿瘤细胞的生长并延长荷瘤小鼠的存活期。
【关键词】：人结直肠癌SW-480细胞 红缘拟层孔菌氯仿提取物(FPKc) 细胞凋亡 活性氧 迁移抑制
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 英文缩略词表10-11
• 第1章 绪论11-17
• 1.1 中医药治疗结直肠癌临床研究现状11-12
• 1.2 红缘拟层孔菌的研究现状12-17
• 1.2.1 化学成分13-14
• 1.2.2 生理活性14-17
• 第2章 论文的立论依据、内容、目的和意义17-19
• 第3章 FPKc制备及色谱分析19-25
• 3.1 材料、试剂与及仪器19
• 3.1.1 材料与试剂19
• 3.1.2 实验仪器19
• 3.2 方法19-21
• 3.2.1 FPKc的制备19-20
• 3.2.2 FPKc高效液相色谱分析20
• 3.2.3 SW-480细胞摄取FPKc成分测定20-21
• 3.3 结果与分析21-22
• 3.3.1 FPKc中三萜类化合物的定性定量分析21
• 3.3.2 SW-480细胞摄取FPKc中三萜类化合物的HPLC分析21-22
• 3.4 讨论22-25
• 第4章 FPKc杀伤结直肠癌细胞及其作用机制研究25-47
• 4.1 材料、试剂与仪器25-28
• 4.1.1 细胞来源及培养25
• 4.1.2 试剂配制25-28
• 4.1.3 仪器设备28
• 4.1.4 实验分组28
• 4.2 方法28-32
• 4.2.1 细胞毒活性分析28-29
• 4.2.2 细胞凋亡率检测29
• 4.2.3 细胞核形态观察29
• 4.2.4 细胞DNA损伤效应29-30
• 4.2.5 细胞周期阻滞分析30
• 4.2.6 Western blotting检测凋亡相关蛋白30-31
• 4.2.7 胞内活性氧(ROS)含量分析31
• 4.2.8 胞内谷胱甘肽(GSH)水平检测31-32
• 4.2.9 ROS对FPKc杀伤SW-480细胞的作用分析32
• 4.2.10 数据分析32
• 4.3 结果与分析32-43
• 4.3.1 FPKc抑制结直肠癌SW-480、Caco-2、SW-620细胞的增殖32-33
• 4.3.2 FPKc诱导SW-480细胞凋亡33-34
• 4.3.3 FPKc对SW-480细胞核形态的影响34-35
• 4.3.4 FPKc引起SW-480细胞G1期阻滞35-36
• 4.3.5 FPKc损伤SW-480细胞DNA36-37
• 4.3.6 FPKc对SW-480细胞内凋亡相关蛋白的影响37-38
• 4.3.7 FPKc导致胞内ROS水平过量积累38-39
• 4.3.8 FPKc下调胞内GSH水平39-40
• 4.3.9 抑制ROS生成显著降低FPK的抗肿瘤作用40-43
• 4.4 讨论43-47
• 第5章 FPKc对SW-480细胞的迁移抑制作用47-51
• 5.1 材料、试剂与仪器47
• 5.2 方法47-48
• 5.2.1 创伤修复实验47
• 5.2.2 Transwell实验47-48
• 5.2.3 基质金属蛋白酶(MMPs)含量分析48
• 5.3 结果与分析48-50
• 5.3.1 FPKc抑制SW-480细胞的迁移48-49
• 5.3.2 FPKc下调MMP-2和MMP-9的表达49-50
• 5.4 讨论50-51
• 第6章 FPKc体内抗肿瘤活性研究51-55
• 6.1 材料、试剂与仪器51
• 6.2 方法51-52
• 6.2.1 实验分组51
• 6.2.2 处理方法51-52
• 6.3 结果与分析52-53
• 6.3.1 FPKc改善荷瘤小鼠生理状态52
• 6.3.2 FPKc抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠存活期52
• 6.3.3 FPKc初步安全性评价52-53
• 6.4 讨论53-55
• 第7章 结论55-57
• 参考文献57-65
• 致谢65-67
• 攻读硕士学位期间的研究成果67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 张丽萍，，苗春艳，张秉信;红缘层孔菌多糖FP_2的结构与体外抗肿瘤作用的研究[J];东北师大学报(自然科学版);1994年02期

2 杨惠英;;结直肠癌病理诊断及误诊原因分析[J];当代医学;2010年14期

3 陈先晖;闫浩;戈群妹;尹婷;周敏;蒋继宏;;红缘拟层孔菌醇提物弱极性成分分析及抗肿瘤、抗氧化活性[J];江苏农业科学;2011年01期

本文编号：1085641