不同DNA转座子在哺乳动物细胞和胚胎中转座活性研究及新转座子的挖掘

发布时间：2018-03-16 10:47

  本文选题：转座子　切入点：整合效率　出处：《中国农业科学院》2014年博士后论文　论文类型：学位论文

【摘要】：转座是一种普遍的生物现象,是生物进化的一种重要机制,也是决定生物基因组差异的重要因素之一。在长期进化中,转座子在不同生物基因组中产生了很大的差异,在哺乳动物中主要活性转座子是反转录座子L1和ERV,而鸟类ERV可能还有一定活性。哺乳动物和鸟类中活性DNA转座子很少,但在鱼类基因组中存在大量的活性DNA转座子。由于一些活性DNA转座子结构简单,且能够通过剪切-粘贴等机制在在基因组上移动,因此被作为非常有效的基因操作工具进行开发利用,如Sleeping Beauty (SB)转座子,目前研究应用较广泛的DNA转座子是SB、PB和To12,在人类基因治疗、转基因制备和功能基因组学研究上的已经取得一些重要进展。但目前对这些转座子的插入偏好性和转座活性,以及在细胞质显微注射中的具体技术参数等理解仍然不够深入细致,需要优化完善；且我国存在对自主知识产权转座子研发不足等问题,本研究针对以上这些问题,系统研究比较了这三种转座系统在细胞和胚胎水平上的转座活性差异,同时对转座子介导细胞质显微注射相关技术参数进行了优化,为该技术在动物转基因、基因治疗和功能基因组学等领域的应用研究提供参考。研究同时尝试利用生物信息学手段,进行高活性DNA转座子的挖掘,为建立自主知识产权转座子技术积累基础。主要研究结果如下：1.将pT3-PGK-NEO转座子质粒和SB、Tol2、PB转座酶质粒分别按不同比例混合共转染MEF和HELA细胞,进行了SB、PB、Tol2整合效率比较。经G418选择培养基培养筛选10-15d后,结果表明：MEF、HELA细胞中To12、PB转座子均在2：1比例时形成的克隆数最多,整合效率最高,而SB转座子在1：1比例时形成的克隆数最多,整合效率最高；且在各组合比例下,SB的整合效率均高于PB和To12,活性最高时,SB的整合效率显著高于PB和To12(p0.05),而PB的整合效率要高于To12。2.将pT3-NEO-T rap转座子质粒和SB、Tol2、PB转座酶质粒分别按不同比例混合共转染MEF和HELA细胞,进行了SB、PB、Tol2基因捕获效率比较。经G418选择培养基培养筛选10-15d后,比较各组细胞克隆数,结果表明：转座子和转座酶比例为2：1时捕获效率最高。PB的捕获效率最高,且在HELA细胞中显著高于SB和To12(p0.05)。3.将pT3-CAG-GFP质粒(20ng)和SB、Tol2、PB三种转座酶的mRNA按浓度10ng,30ng,50ng分别混和,进行小鼠受精卵细胞质注射,培养至4天进行荧光检测,在胚胎水平比较转座活性差异,结果表明三种转座子GFP阳性胚胎率都在30%以上,其中PB在转座酶mRNA浓度50ng/ul时GFP阳性率最高,达到50%以上显著高于10ng/ul和30ng/ul组(p0.05),且显著高于SB和To12转座子(p0.05)；SB和To12在转座酶mRNA浓度30ng/ul时GFP阳性率最高,分别为45.00%和37.16%。To12转座子相对低于SB和PB转座子。4.通过斑马鱼、青溕、刺鱼、金娃娃4个代表性硬骨鱼类转座组解析发现,硬骨鱼类转座子多样性程度和转座活性很高,是活跃基因组,基因组大小差异主要是由转座组的不同程度扩张引起的,而转座组差异主要由于DNA转座子的不同程度扩张引起的。其中两个DNA超家族转座子(hAT和Tcl/Mariner)是硬骨鱼转座组扩张的主要成份,且hAT和Tcl/Mariner超家族转座子均存在多个结构完整的成员存在,提示其是活跃家族。反转录转座子家族在四个物种扩张也存在较大差异,在斑马鱼和刺鱼基因组中发现多个活性很强的反转录转座子(DIRS、Gypsy、L1及L2)。5.通过生物信息分析及细胞和胚胎实验验证,结果表明在斑马鱼基因组中Tel转座子的各成员活性存在较大差异,其中Tcl-c是最年轻转座子,能够在哺乳动物MEF和HELA细胞中有效转座,并在鼠胚胎有效介导GFP基因转移,其活性与现有的SB转座子的活性相近。总体而言,本研究结果表明,在细胞水平,SB的整合效率最高,而PB的基因捕获效率最高。在胚胎水平,PB转基因效率最高。新发现的斑马鱼Tcl-c转座子具有较高的转座活性,具有应用前景。本研究同时证实转座子介导细胞质显微注射技术具有可行性,且获得一系列细胞和胚胎水平的优化转座子技术参数。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q78

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本文编号：1619592