两株禽呼肠孤病毒分离株生物学特性分析及间接ELISA方法的建立

发布时间：2019-03-26 12:37

【摘要】：禽呼肠孤病毒病是由禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus, ARV)引起禽类的一类传染病,感染率较高。自1954年首次从患慢性呼吸道疾病的肉用型鸡的呼吸道内分离到该病毒,随后又从蛋鸡、火鸡和番鸭中分离到该病毒。流行病学调查发现,ARV在鸡群中流行相当普遍,给养禽业带来了巨大的损失。但目前ARV毒株分离较少,所以对于ARV的生物学特性、遗传进化、致病性等方面的相关报道也较少见。ARV的结构蛋白σB与aC是能够诱导机体产生中和抗体的主要宿主保护性抗原,然而其抗原决定簇——表位信息仍不清楚。抗体检测方法中,病毒中和实验,琼脂扩散实验等耗时耗力、敏感性低,ELISA试剂盒多为进口,价格昂贵,尚无具有自主知识产权的国产ELISA试剂盒,不利于该病的防控。因此本研究致力于完成ARV毒株的生物学特性研究及诊断方法的建立。为了解ARV的生物学特性,对本实验室分离到的两株ARV毒株(ARV10-JS01株和ARV10-HB02株)进行了全基因组测序。序列分析结果表明：两株病毒各个基因片段核苷酸同源性均在99.5%以上,与大部分的引起关节炎的ARV毒株核苷酸同源性较高,表明这两株病毒均为关节炎型呼肠孤病毒。测定了两个毒株的组织细胞培养半数感染量(TCID50)和鸡胚半数致死量(ELD50),结果发现ARV10-JS01分离株的组织细胞培养半数感染量(3.75x108)明显高于ARV10-HB02(3.5x107),而ARV10-HB02分离株的鸡胚半数致死量(6.63x107)要明显高于ARV10-JS01分离株(1.12x106)。体外复制动力学分析显示,ARV10-JSO1的复制速度较慢,但复制滴度显著高于ARV10-HB02。说明两株病毒在CEF上的复制特性存在显著差异 σB和σC蛋白是ARV的两个主要的外壳蛋白,可诱导机体产生群特异性中和抗体,σC与σB蛋白相互作用,在ARV的感染及其致病性上起重要的作用。为探究ARV10-JS01株和ARV10-HB02两株病毒在抗原性上的差异,本实验通过对两蛋白进行表达、纯化,分别制备了针对这两个蛋白的单克隆体。利用肽扫描技术对抗σB单克隆抗体1F4和1H3-1的表位信息进行研究,鉴定出两个最小线性抗原表位21-26aa和32-38aa,两表位序列在ARV毒株σB蛋白中相当保守,而在番鸭和火鸡呼肠孤病毒的σB蛋白序列间保守性较低且交叉反应结果为阴性,说明这两个线性表位为ARV特异性抗原表位；用抗σC单克隆抗体对ARV σC蛋白进行扫描,45-54aa为其最小线性抗原表位,与国际标准毒S1133属同一进化分支的ARV毒株中该表位非常保守,而在其他分支ARV及DRV毒株间保守性较低且交叉反应结果为阴性,表明该表位为S1133型特异性抗原表位。另外,将ARV10-JS01与ARV10-HB02分离株的抗原表位信息进行比较发现,两株病毒σB和aC蛋白的抗原表位非常保守。对ARV σC与σB蛋白进行抗原表位的鉴定,有利于进一步阐明σC与aB蛋白的结构与功能,为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和开发表位疫苗奠定重要的理论基础。此外,利用原核表达系统成功表达了σB和σC蛋白,将纯化后的重组GB和6C蛋白作为包被抗原,建立了检测ARV抗体的ELISA方法。并通过对反应条件进行优化,确定了最佳反应程序。对该方法的特异性、符合率、敏感性、抗体消长规律等指标进行测定,结果表明其特异性好、敏感性高、与其他检测方法符合率较高,对免疫鸡抗体消长规律测定准确,可应用于ARV的流行病学调查及免疫监测。本研究完成了两株ARV分离株的全序列测定及体外生物学特性分析,丰富了ARV的基因组序列信息。制备σB和σC蛋白单克隆抗体,筛选到2个σB抗原表位和1个σC抗原表位,为进一步了解其抗原结构和功能奠定了基础。以σB和σC蛋白为包被原,建立了用于ARV抗体检测的ELISA方法,该方法各项检测指标良好,具有进一步开发为商品化试剂盒的潜力,为ARV的流行病学调查与监测提供技术支撑。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S852.65

【参考文献】