苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘

发布时间：2019-11-28 04:42

【摘要】：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt），革兰氏阳性细菌，在芽胞形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体。Bt晶体主要由cry基因编码的杀虫晶体蛋白组成，在害虫的防治中具有重要作用，有巨大的商业价值，因此发掘新基因并进行知识产权保护是Bt资源研究的重要内容。知识产权作为综合竞争力的重要体现，而目前我国在Bt杀虫基因资源的知识产权方面处于劣势，大部分Bt杀虫基因的专利权掌握在西方各大型农业生物技术企业手中，我国掌握的Bt新的基因发明专利不足60项。高通量测序技术的发展为发掘杀虫基因提供了新思路，成为国内外发掘Bt杀虫基因的主要手段。但是测序价格较高，Bt资源库中存在的冗余菌株会造成较大的资金浪费，目前尚没有便捷的方法去除重复菌株。因此，迫切需要建立可以快速分析比较大量样品的方法，来排除重复菌株，进一步提高杀虫基因发掘效率。本论文在分离1500株Bt菌株的基础上，进一步建立了菌株多样性分析方法，对菌株多样性进行研究，去除冗余菌株，对其中90株菌株进行了杀虫基因测序筛选，主要结果如下： Bt菌株分离与鉴定：杀虫活性评估结果显示多数菌株对鳞翅目害虫有较高活性，1500株测试菌株中，对棉铃虫有活性的菌株有1346株，对玉米螟有活性菌株有813株，而对叶甲类害虫大猿叶甲有活性的菌株较少，只有42株；镜检结果显示不同菌株产生的晶体形状、大小、种类有较大差异，晶体种类主要为菱形，部分为球形和不规则的晶体形状；杀虫晶体蛋白图谱显示大部分菌株表达了130kD蛋白，部分菌株还表达了100Kd、60kD蛋白，具有典型Bt杀虫晶体蛋白的特征；质粒图谱显示不同菌株质粒图谱条带数量和大小都有所不同，并且有部分菌株图谱相似，说明资源库中有冗余菌株。 建立Bt菌株多样性分析方法：首先，设计了可以扩增多个基因家族的兼并引物，fastPCR软件分析结果显示该引物可以对超过30种的杀虫基因家族进行较好的扩增，PCR实验检测显示，该引物可以扩增出预期条带但是条带较弱。进一步通过增加侧翼特异序列的办法对兼并引物进行改良，改良后的引物显著提高了扩增效率。同时，还对引物浓度与退火温度进行了优化，利用72个不同血清型的标准菌对优化后的PCR体系进行了评估，结果显示95%以上的菌株都可以获得预期条带；利用含有多个基因的HD12菌株评估了优化后体系对多个基因同时扩增的能力，结果显示优化后的PCR可以从HD12获得9种不同的RFLP类型。这些结果说明优化后的PCR体系具备了cry基因指纹图谱的基本要求。此外，本论文还对Bt基因组提取方法进行了改良，改良后的方法可以提取并获得质量均一的基因组DNA。用改良的PCR体系对Bt基因组进行扩增，并用HinfI对PCR产物进行消化，利用LabChip GX电泳系统进行分析，获得了888个菌株的RFLP图谱。进一步对电泳图谱进行数字化、计算相似性、构建系统发生树分析。结果显示，该方法可以有效分析菌株多样性，去除冗余菌株，获得可用于进一步基因发掘的菌株。 90株Bt菌株杀虫基因测序筛选：利用高通量测序技术分析了90株不同的Bt菌株的序列，进一步通过SOAPdenovo软件拼接、GeneMark基因预测、模式杀虫基因数据库及专利数据库blast比对，最终获得全新杀虫基因21个。 总之，本论文建立菌株多样性研究方法，解决了冗余菌株会造成资金的浪费的问题，最终完成了“菌株分离去除冗余基因测序筛选”这一杀虫基因高通量发掘平台的构建，为提升我国在Bt资源发掘中的竞争力提供了重要保障。
【图文】：

引 言胞杆菌及其多样性胞杆菌菌（Bacillus thuringiensis，简称 Bt），芽胞杆菌属革兰氏阳划分为许多不同的亚种，到 2005 年 1 月，鉴定的苏云金芽胞[ 1]，即使在同一个血清型或亚种中，不同菌株的特性也会有准菌株可以从美国俄亥俄州立大学的芽胞杆菌遗传资源ter，www.bgsc.org)获得。Bt 在病死昆虫、土壤、储藏物、尘的分布，而作为微生物大本营的土壤，是 Bt 菌株的主要来源

图 1-2 Bt 用邻接法建立的 Bt 鞭毛蛋白氨基酸序列进化树Fig.1-2 Neighbor-joining tree generated from Bt flagellin amino acid sequences们首先分析了苏云金芽胞杆菌抗原蛋白(H antigen [Hag])序列多样性[ 8]，并进一步行了比较。结果显示该蛋白C端111个氨基酸与N端66个氨基酸是保守的，称为C序列聚类结果分析显示，多数情况下不同血清型的苏云金芽胞杆菌的抗原蛋白也同血清型的菌株的蛋白通常聚集在一起，但是也有部分菌株抗原蛋白与血清型聚小组进一步分析了鞭毛蛋白基因 fliC，结果显示，尽管大部分不同血清型的菌株 F同，，但是聚类分析结果显示鞭毛蛋白基因序列与菌株血清型没有相关性[ 7]。对来的 23 个亚型的 39 个菌株进行的血清型亚型（serovars）与抗原蛋白基因之间相关性些基因在数量上和序列上都有一定的多样性，并且在一些特定亚型上发现了亚型特列。与对菌株进行不同血清做免疫反应相比 PCR 分析比较相关编码基因序列更为析苏云金芽胞杆菌鞭毛抗原蛋白基因序列在其血清型分类研究上具有较好的应用
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S476.1

【引证文献】

相关博士学位论文 前1条

1 杨静妮;苏云金芽胞杆菌芽胞期母细胞裂解机制的研究[D];东北农业大学;2013年

相关硕士学位论文 前2条

1 熊静;利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用[D];湖南师范大学;2014年

2 张巧铃;Bt生物被膜产生菌的筛选与鉴定[D];福建农林大学;2014年

本文编号：2566908