GsCHX19基因对肇东紫花苜蓿的遗传转化及新株系的培育

发布时间：2017-06-22 12:14

  本文关键词：GsCHX19基因对肇东紫花苜蓿的遗传转化及新株系的培育，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：我国盐碱地面积约9913万公顷,近年来还有逐步扩大的趋势。伴随着畜牧业的快速发展,饲料与食用粮需求量大幅上升,而东北地区存在大面积盐碱地土壤,也严重限制了粮食及畜牧业的发展。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)素有“牧草之王”的美誉,它作为重要的饲料作物的同时,也是改良土壤和保持水土的重要作物。随着基因工程技术的利用与发展的日益成熟,转基因苜蓿的研究同样也有着良好的发展势头,其中,以农杆菌介导苜蓿子叶节的方法,因其具有易操作,转化效率高,外源基因整合拷贝数少等特点,克服了传统遗传育种的缺点,成为培养苜蓿抗逆性新品系中最有效的手段之一。培育耐盐碱转基因苜蓿可以充分利用我国盐碱地资源,提高苜蓿产量,对发展畜牧业和改善生态环境具有重要意义。CHX(cation/H+exchanger)是植物体内存在于细胞质膜或液泡膜等细胞膜上,编码Na+、K+/H+反向转运蛋白的一类基因家族。CHX基因家族属于CPA(cation/proton antiporter)超家族。CPA超家族通过Na+、Li+或K+交换H+以调节细胞内阳离子和p H稳态。原核生物及真核生物CPA超家族主要包括CPA1和CPA2两类。植物体中的CPA1与细菌的NhaP具有很高的序列相似性,包括研究较为广泛的NHX(Na+/H+exchanger)家族。相对研究较少的CPA2家族包括KEA(K+-efflux antiporter)和CHX,其中CHX与酵母KHA1及Synechocystis的NhaS4有很高的序列相似性。目前研究表明,CHX蛋白仅存在于高等植物中,约800个氨基酸,包括N末端约400残基的疏水性Na+/H+交换器以及C末端约300~400的亲水性结构域。由于亲水C末端不包含已知的保守结构域,因此它的功能是未知的。但是并不是所有的CHX都具有这样的特性。例如,预测来自细菌的NhaS4蛋白编码715个氨基酸,实际上只编码410个。本实验室前期已得到具有自主知识产权、在非生物胁迫反应中起重要作用的Gs CHX19基因与pCAMBIA330035S植物表达载体连接,用农杆菌介导法转化紫花苜蓿,获得了转基因植株。通过生物信息学方法及分子生物学方法确定得到新的耐盐碱综合改良苜蓿新品系。本研究为耐盐碱转基因苜蓿的培育,提供了重要的研究材料。主要研究结果如下:(1)GsCHX19基因的生物信息学分析盐碱胁迫应答基因Gs CHX19基因是本实验室在前期研究中获得,本研究所选用的CHX19基因来源于野生大豆碱胁迫转录组数据,该基因在转录水平积极响应碱胁迫的诱导,推测其可能积极参与了碱胁迫信号传导途径,在碱胁迫通路中具有重要的功能。通过生物信息学方法,对基因编码蛋白进行理化性质、亲疏水性、磷酸化位点、跨膜结构域和功能注释等生物信息学分析,并预测其蛋白的结构域,预测该基因上游启动子的渗透胁迫相关调控元件,为下一步研究提供依据。(2)GsCHX19基因对紫花苜蓿的遗传转化和抗性植株的获得以肇东紫花苜蓿为受体材料,采用农杆菌介导法将已得到具有自主知识产权、在非生物胁迫反应中起重要作用的GsCHX19基因与pCAMBIA330035Su植物表达载体连接,对苜蓿进行遗传转化,转化的受体为苜蓿子叶节,通过再生体系获得抗性植株20株。(3)转GsCHX19基因抗性植株的分子生物学检测对获得的20株转GsCHX19基因抗性植株进行PCR检测,获得PCR阳性植株16株,PCR阳性率为80%;对PCR阳性植株进行RT-PCR检测,获得11株GsCHX19基因在转录水平上超量表达的植株,RT-PCR阳性率为68.75%。
【关键词】：苜蓿 GsCHX19基因 生物信息学 转基因株系
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S541.9
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-22
• 1.1 本研究的目的与意义12
• 1.2 文献综述12-20
• 1.2.1 植物耐盐机制研究12-14
• 1.2.2 CHX基因家族的研究进展14-15
• 1.2.3 苜蓿基因工程研究进展15-17
• 1.2.4 生物信息学在植物生物工程中的应用17-20
• 1.3 主要研究内容与技术路线20-22
• 1.3.1 本研究的课题来源20
• 1.3.2 本研究的主要内容与技术路线20-22
• 2 材料与方法22-32
• 2.1 基于盐碱胁迫野生大豆转录组数据的GsCHX19基因的筛选22
• 2.1.1 试验材料22
• 2.1.2 试验方法22
• 2.2 野生大豆盐碱胁迫关键基因GsCHX19的生物信息学分析22-23
• 2.2.1 试验材料22
• 2.2.2 试验方法22-23
• 2.3 农杆菌介导苜蓿的遗传转化及抗性植株的获得23-27
• 2.3.1 试验材料23-25
• 2.3.2 试验方法25-27
• 2.4 转基因抗性植株的分子生物学检测27-32
• 2.4.1 试验材料27-28
• 2.4.2 试验方法28-32
• 3 结果与分析32-48
• 3.1 GsCHX19基因生物信息学分析32-41
• 3.1.1 GsCHX19基因分析32-33
• 3.1.2 GsCHX19蛋白序列的分析33-37
• 3.1.3 GsCHX19蛋白结构域及功能预测37-39
• 3.1.4 蛋白质结构的分析39-41
• 3.2 苜蓿的遗传转化及抗性植株的获得培养41-44
• 3.2.1 植物表达载体pCAMBI A330035Su- Gs CHX 19转化农杆菌41-42
• 3.2.2 苜蓿遗传转化及抗性植株的获得42-44
• 3.3 转基因抗性植株的分子生物学检测44-48
• 3.3.1 转GsCHX19基因抗性植株的P CR检测44-45
• 3.3.2 PCR阳性植株的RT-P CR检测45-46
• 3.3.3 Real- time PCR鉴定46-48
• 4 讨论48-50
• 4.1 GsCHX19基因的生物信息学分析48
• 4.2 转基因苜蓿培育与筛选48-49
• 4.3 下一步工作展望49-50
• 5 结论50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-57
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文57

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1 杨浩;GsCHX19基因对肇东紫花苜蓿的遗传转化及新株系的培育[D];东北农业大学;2016年

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本文编号：471807