不同地区苏云金芽胞杆菌vip3Aa基因的鉴定及杀虫活性分析

发布时间：2017-06-25 01:04

  本文关键词：不同地区苏云金芽胞杆菌vip3Aa基因的鉴定及杀虫活性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：全球农业的健康发展一直受到农业害虫的制约,农业害虫的防控和治理,多年来主要依靠化学农药。化学农药大剂量、大范围的施用对生态系统造成非常严重的破坏,对全球农业的可持续发展构成威胁。采用生防的手段可以有效的解决这些难题,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫活性高,而且对人、畜等非靶生物无害,现已成为使用最为普遍的环境友好型杀虫微生物。然而,长期施用Bt制剂使部分敏感的农业害虫产生了抗性,目前应用的Bt菌株存在杀虫谱窄和毒力低等缺点,因此我们要筛选新型高毒力的Bt基因来满足生防的需求,扩大Bt的杀虫谱,丰富转基因资源。本研究首次比较了中国不同气候类型(热带-海南省,亚热带-广西省,温带-黑龙江省)的Bt菌株和vip基因的分布情况。从海南841份土样中分离出156株Bt菌(18.55%),从广西1420份土样中分离出356株Bt菌(25.07%),从黑龙江1010份土样中分离出167株Bt菌(16.53%);从海南的156株Bt菌鉴定出22个vip3基因(14.10%),广西的356株Bt菌鉴定出2个vip3基因(5.62%),黑龙江的156株Bt菌没有鉴定出vip3基因(0%)。本实验利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法成功从海南的SL3和SL4 Bt菌株分别鉴定、克隆出vip3Aa的全长基因,并获得登录号KP309808和KT792883,经Bt国际命名委员会正式命名为vip3Aa57和vip3Aa62。将这两个基因插入到表达载体pET-21b,转化菌株Rosetta(DE3),在低温条件下均表达88 k Da大小的蛋白。将蛋白进行生物活性测定,结果显示Vip3Aa57蛋白对甜菜蛾(Spodoptera exigua)有体重抑制的作用,对棉铃虫(Heliothis armigera)无明显的生物活性;Vip3Aa62蛋白对甜菜蛾具有较好的杀虫活性,LC50为5.124 ng/mg;对棉铃虫活性较低,LC50为870.1 ng/mg。石蜡切片结果显示Vip3Aa57蛋白使甜菜蛾中肠细胞的形态发生变化。通过这些研究结果表明Bt菌株和vip基因的分布有地域性差异,在温度较高的热带、亚热带地区有比较丰富的Bt菌株和vip基因资源。本研究将有利于充分利用土壤中的Bt菌株,分离具有自主知识产权和重要应用价值的新型vip抗虫基因,这将会为研究新型杀虫蛋白,延缓害虫抗性问题提供有利帮助。
【关键词】：苏云金芽胞杆菌 vip基因 鉴定 气候类型 生物活性测定
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-26
• 1.1 苏云金芽胞杆菌11-12
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白12-15
• 1.2.1 杀虫晶体蛋白的类型12
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白的作用机理12-14
• 1.2.3 杀虫晶体蛋白的应用14-15
• 1.3 营养期杀虫蛋白15-22
• 1.3.1 营养期杀虫蛋白的分类15-17
• 1.3.2 营养期杀虫蛋白的作用机理17-22
• 1.3.3 营养期杀虫蛋白的应用前景22
• 1.4 杀虫蛋白的鉴定方法22-24
• 1.4.1 PCR-RFLP鉴定22
• 1.4.2 分子杂交鉴定22-23
• 1.4.3 蛋白鉴定23
• 1.4.4 HRM检测方法23-24
• 1.4.5 PCR-HTS检测方法24
• 1.5 重要农业害虫24-25
• 1.5.1 甜菜蛾24
• 1.5.2 棉铃虫24-25
• 1.6 本研究的立题依据和目的意义25-26
• 2 材料与方法26-40
• 2.1 实验材料26-32
• 2.1.1 菌株与质粒26
• 2.1.2 化学试剂及酶试剂26-27
• 2.1.3 培养基27
• 2.1.4 抗生素27
• 2.1.5 常见溶液和缓冲液27-31
• 2.1.6 供试昆虫31
• 2.1.7 仪器设备31-32
• 2.1.8 标准分子量32
• 2.2 实验方法32-40
• 2.2.1 菌株的分离32-33
• 2.2.2 晶体形态观察33
• 2.2.3 Bt基因组的提取33
• 2.2.4 引物设计33
• 2.2.5 PCR扩增33-34
• 2.2.6 酶切反应34-35
• 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳检测35
• 2.2.8 DNA胶回收35
• 2.2.9 重组反应35
• 2.2.10 E.coli感受态细胞制备35-36
• 2.2.11 热击转化36
• 2.2.12 大肠杆菌质粒的提取36
• 2.2.13 vip3Aa基因在E.coli中诱导表达36-37
• 2.2.14 Ni-Agarose His标签蛋白亲和层析蛋白质37
• 2.2.15 SDS-PAGE电泳37
• 2.2.16 蛋白定量的方法37-38
• 2.2.17 杀虫活性测定及数据处理38
• 2.2.18 石蜡切片38-40
• 3 结果与分析40-49
• 3.1 Bt菌株的分离鉴定40-41
• 3.2 vip3类基因的鉴定41-43
• 3.2.1 vip3基因的鉴定41-42
• 3.2.2 vip3Aa基因的鉴定42-43
• 3.3 vip3Aa类基因的克隆表达及序列分析43-44
• 3.4 Vip3Aa蛋白的纯化44-45
• 3.5 室内杀虫活性测定45-47
• 3.5.1 初筛45-46
• 3.5.2 复筛46-47
• 3.6 石蜡切片47-49
• 4 讨论49-51
• 5 结论51-52
• 致谢52-53
• 附录53-54
• 参考文献54-60
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李玉红;李海涛;高继国;赵世源;张春鸽;赵灿;;苏云金芽胞杆菌cry2Ab、cry9Ea基因的表达及活性分析[J];生物技术通报;2012年10期

2 李怡萍;梁革梅;仵均祥;陈豪;马康生;吴孔明;郭予元;;苏云金芽孢杆菌杀虫机理及害虫对其抗性机制的研究进展[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2010年09期

3 邓立新;生物农药苏云金芽孢杆菌杀虫剂及其增效剂[J];化学教学;2004年03期

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本文编号：480161