保加利亚乳杆菌ATCC 11842酸耐受机制关键基因的表达分析

发布时间：2017-07-14 02:18

  本文关键词：保加利亚乳杆菌ATCC 11842酸耐受机制关键基因的表达分析

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【摘要】：酸奶中的乳酸菌能将大分子蛋白质分解成人体易吸收的小分子营养物质,这对人体具有很重要保健功能,但酸奶严重的后酸化问题不仅严重影响风味,还大大缩短了酸奶的货架期,阻碍了我国酸奶行业发展。经无数学者的研究证明控制保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)在发酵后期的生长代谢是解决酸奶严重后酸化关键。乳酸菌需要克服生产、贮藏、运输过程中发酵介质的酸性环境,还要克服人体胃肠道的酸性环境(pH2.5-3.5)才可以到达小肠发挥益生作用[2-3]。保加利亚乳杆菌的耐酸能力在发酵酸奶、酸奶后酸化和发挥胃肠道益生功能中扮演着重要角色。保加利亚乳杆菌属于嗜酸乳杆菌菌群,其在世界范围内广泛应用于酸奶等发酵乳品生产,成为最具经济价值的同型发酵乳酸菌之一。Adolfsson O.和Shihata A.的研究中证明该菌种具有维持人体胃肠道菌群生态平衡、抑制肠道内病原菌滋长、和提高机体免疫力的益生功能。尽管对其进行了大量研究,但大多集中在其发酵性能和应用方面的研究,但是对此菌的代谢机制等方面研究甚少。本研究通过研究模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在脱脂乳复原培养基中的基本生长特性和产酸特性,选取总RNA提取的时间,提取总RNA后进行半定量RT-PCR试验,其中以16S rDNA基因作为内参基因,对参与保加利亚乳杆菌ATCC11842菌株酸耐受机制的一些相关基因在不同生长时期的表达情况进行检测；根据半定量RT-PCR的结果,选取出在表达量上存在差异比较明显的基因进行进一步深入研究,以期能够探究出差异基因在酸奶后酸化过程中的相关机理。研究结果表明(1)模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在脱脂乳中发酵11h到达发酵终点,发酵终点pH至为4.8、活菌数为2.3×108 CFU/mL;发酵结束后立即将发酵脱脂乳放到4℃贮藏,7d后测得pH值为4.6、活菌数1.5×108 CFU/mL。(2)选取4个不同时期提取总RNA,分别是发酵对数中后期(pH 5.3)、发酵终点(pH 4.8)、完成发酵后于4℃C冰箱降温2 h、4℃贮藏7d(pH 4.6)。通过电泳检测、紫外分光光度计检测和RT-PCR检测总RNA提取质量,确定质量合格。进行半定量RT-PCR试验,发现tpiA基因在在不同发酵时期的表达差异比较明显,在后酸化期表达量明显高于其他三个时期。(3)本研究针对这一基因进行深入研究：构建重组载体V1和V2,V1是由正向的tpiA基因和质粒pMG36e重组构成,V2是由反向的tpiA基因和质粒pMG36e重组构成。将质粒pMG36e和V1成功的转化到保加利亚乳杆菌ATCC 11842中,结果表明该基因过表达与对照菌株相比其pH变化一致,但是菌株在稳定期的OD值稍有下降,由此证明过量表达该基因对该菌株产酸没有太大影响。本研究为深入研究保加利亚乳杆菌的酸耐受机制调控网络提供更多有价值的信息,为开发具有自主知识产权的弱后酸化能力的酸奶发酵剂提供理论依据。
【关键词】：保加利亚乳杆菌 后酸化 转录组学 半定量RT-PCR 丙糖异构酶基因
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS252.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-19
• 1.1 乳酸菌过度产酸对酸奶品质的影响10-12
• 1.1.1 通过添加外来物控制菌的生长和产酸能力11
• 1.1.2 在酸奶发酵剂中调整保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例11-12
• 1.1.3 生物技术育种12
• 1.2 乳酸菌耐酸受机制的研究进展12-15
• 1.2.1 乳酸菌酸耐受机制的研究进展13-14
• 1.2.2 保加利亚乳杆菌酸耐受机制的研究进展14-15
• 1.3 基于高通量测序技术的乳酸菌酸耐受机制解析15-17
• 1.3.1 基因组学15
• 1.3.2 转录组学15-16
• 1.3.3 半定量RT-PCR技术16-17
• 1.4 提升乳酸菌酸胁迫抗性的策略研究17-18
• 1.4.1 代谢途径策略提升乳酸菌酸胁迫抗性17
• 1.4.2 基于乳酸菌应激反应机制提升乳酸菌酸胁迫抗性17-18
• 1.5 本文研究的内容和意义18-19
• 2 材料19-25
• 2.1 菌株和质粒19
• 2.2 培养基19
• 2.3 试剂19-20
• 2.3.1 主要生化试剂19-20
• 2.3.2 主要分子生物学试剂20
• 2.4 主要仪器设备20-21
• 2.5 试验试剂及缓冲液的配制21-23
• 2.5.1 基因组提取试剂21
• 2.5.2 大肠杆菌感受态制备相关试剂的配制21
• 2.5.3 大肠杆菌质粒提取试剂21
• 2.5.4 保加利亚乳杆菌ATCC 11842原生质体制备试剂21-22
• 2.5.5 乳酸菌质粒提取试剂22
• 2.5.6 其它试剂的配制22-23
• 2.6 引物设计23-25
• 3 试验方法25-41
• 3.1 真空冷冻干燥的保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株的复苏培养及分子鉴定25-27
• 3.1.1 菌株的复苏培养25
• 3.1.2 菌株的分子鉴定25-27
• 3.2 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在MRS和RSM复原脱脂乳培养基中的生长特性及产酸特性的研究27-28
• 3.2.1 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在MRS培养基中的生长曲线27-28
• 3.2.2 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在RSM复原脱脂乳培养基中的生长曲线及产酸特性28
• 3.3 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在RSM复原脱脂乳中发酵不同时期总RNA的提取及反转录28-31
• 3.3.1 不同发酵时期保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株总RNA的提取28-30
• 3.3.2 提取总RNA的质量检测30
• 3.3.3 反转录30-31
• 3.4 半定量RT-PCR31-33
• 3.5 tpiA基因的克隆及功能分析33-41
• 3.5.1 tpiA基因的PCR克隆33-35
• 3.5.2 DNA的回收纯化及测序35
• 3.5.3 大肠杆菌DH5a中提取质粒pMG36e及单酶切鉴定35-36
• 3.5.4 tpiA基因的超量表达载体和反义载体的构建36-37
• 3.5.5 重组载体电击转化电转化大肠杆菌37-39
• 3.5.6 质粒pMG36e和重组载体V1电击转化电转化保加利亚乳杆菌ATCC 1184239-40
• 3.5.7 后酸化关键基因的功能分析40-41
• 4 结果与分析41-56
• 4.1 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在光学显微镜下的形态和菌落形态41-42
• 4.2 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在MRS液体培养基中的生长曲线和产酸特性42-43
• 4.3 保加利亚乳杆菌ATCC 11842菌株在RSM复原脱脂乳培养基中的生长特性和产酸特性43-46
• 4.4 4个不同发酵时期的总RNA的提取及定量分析46-49
• 4.4.1 不同的细胞裂解方案对总RNA提取的影响46-47
• 4.4.2 不同的醇沉条件对总RNA提取的影响47-49
• 4.5 半定量RT-PCR检测基因转录水平差异49-50
• 4.6 tpiA基因的克隆及功能分析50-56
• 4.6.1 tpiA基因的PCR扩增50-51
• 4.6.2 质粒pMG36e提取及验证结果51-52
• 4.6.3 重组载体的构建52-54
• 4.6.4 tpiA基因的功能分析54-56
• 5 讨论56-59
• 5.1 酸奶后酸化问题56
• 5.2 脱脂乳中乳酸菌总RNA的提取56-57
• 5.3 tpiA基因的简介及作用机理57-59
• 6 结论59-60
• 参考文献60-65
• 附录65-68
• 在校期间发表的学术论文68-69
• 作者简介69-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 崔艳华;曲晓军;马莺;;双组分系统分析预测共生机制[J];哈尔滨工业大学学报;2010年11期

2 付瑞燕;李寅;;利用代谢工程技术提高工业微生物对胁迫的抗性[J];生物工程学报;2010年09期

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本文编号：539303