来源于Caldibacillus cellulovorans的耐热甘露聚糖酶的全基因合成，表达及酶学性质分析

发布时间：2017-08-03 13:23

  本文关键词：来源于Caldibacillus cellulovorans的耐热甘露聚糖酶的全基因合成，，表达及酶学性质分析

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【摘要】：甘露聚糖酶(mannanase)来源广泛,大量存在于植物,动物和微生物。其中微生物存在种类繁多、性质优良的甘露聚糖酶,且易于培养,是理想的β-甘露聚糖酶来源。已有大量来源于细菌的甘露聚糖酶被研究,其中耐热甘露聚糖酶的研究仍受到科学家们的关注。在食品、饲料等众多行业中,需要大量高温环境下使用的生物活性添加剂,其相关高反应温度,耐热性好的酶类仍然缺乏研究。国内外已有研究出的耐热甘露聚糖酶,目前还没有能够得到很好推广利用,应用很有限,其原因是市场供给不足,酶学性质难以工业化使用,并且价格高。挖掘出耐热效率高并利用高效表达系统使该甘露聚糖酶进行外源高效率表达,从而低成本、规模化地大量生产甘露聚糖酶酶供更多人所用,无疑是解决这一问题的有效方法之一。本研究应用基因工程,蛋白工程和发酵工程技术获得具有自主知识产权的甘露聚糖酶高产工程菌,为甘露聚糖酶在食品与饲料方向的工业化应用提供理论依据和条件,本研究主要工作包括以下内容:在不改变耐热甘露聚糖酶ManAd3原始氨基酸序列的基础上,根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列,为了提高甘露聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中的表达量,参照巴斯德毕赤酵母密码子使用情况,优先选择毕赤酵母最偏爱的密码子,部分使用次偏好密码子,从而尽量消除mRNA稳定的二级结构,设计并全基因合成了甘露聚糖酶基因ManAHr(Accession No.KJ806637)。将人工合成的甘露聚糖酶基因ManAHr利用基因工程技术与pPIC9k质粒进行连接,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9k-ManAHr,并将其转化毕赤酵母GS115得到重组子,该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManAHr含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。通过发酵罐发酵条件的优化,寻找重组蛋白的表达的最佳发酵条件,通过甲醇与甘油不同比例的混合补料,有效的避免了甲醇中毒情况,进一步提高了甘露聚糖酶的产量。实验结果表明,重组甘露聚糖酶酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75°C,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75°C下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManAHr因表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域,根据目前发酵罐小试的产量,在工业化大规模生产中前景广泛。
【关键词】：甘露聚糖酶 毕赤酵母 基因合成 耐热性 发酵罐
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-20
• 1.1 甘露聚糖12-14
• 1.1.1 甘露糖的来源和分类12-13
• 1.1.2 甘露糖的作用13-14
• 1.2 甘露聚糖酶14-17
• 1.2.1 β-甘露聚糖酶的来源及其性质14-15
• 1.2.2 β-甘露聚糖酶的分离纯化15-16
• 1.2.3 β-甘露聚糖酶酶活分析16
• 1.2.4 β-甘露聚糖酶的应用16-17
• 1.3 外源基因表达系统17-19
• 1.3.1 巴斯德毕赤酵母简介17-18
• 1.3.2 表达载体18-19
• 1.4 研究目的和意义19-20
• 第二章 甘露聚糖酶ManAHr在毕赤酵母中的表达20-36
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 菌种与质粒20
• 2.1.2 引物合成20
• 2.1.3 工具酶和生化试剂20
• 2.1.4 实验仪器20-21
• 2.1.5 实验相关培养基21
• 2.1.6 实验相关溶液21-22
• 2.2 实验方法22-29
• 2.2.1 甘露聚糖酶基因ManAHr的改造设计22-23
• 2.2.2 甘露聚糖酶ManAHr的载体构建23-24
• 2.2.3 甘露聚糖酶ManAHr表达载体的构建24-26
• 2.2.4 甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中表达26-28
• 2.2.5 目标蛋白SDS-PAGE的分析28-29
• 2.3 实验结果与分析29-34
• 2.3.1 甘露聚糖酶基因ManAHr的改造设计29
• 2.3.2 甘露聚糖酶ManAHr表达载体的构建29-32
• 2.3.3 甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中表达32-34
• 2.3.4 目标蛋白SDS-PAGE的分析34
• 2.4 本章小结34-36
• 第三章 甘露聚糖酶ManAHr酶学性质的鉴定36-42
• 3.1 实验材料36
• 3.1.1 菌种36
• 3.1.2 工具酶和生化试剂36
• 3.1.3 实验仪器36
• 3.1.4 常用溶液36
• 3.2 实验方法36-38
• 3.2.1 甘露糖及蛋白质含量标准曲线的制度36-37
• 3.2.2 最适pH的测定37
• 3.2.3 甘露聚糖酶ManAHr的最适反应温度检测37
• 3.2.4 甘露聚糖酶ManAHr的热稳定性检测37-38
• 3.2.5 发酵上清液中甘露聚糖酶含量的检测38
• 3.3 结果与分析38-40
• 3.4 本章小结40-42
• 第四章 甘露聚糖酶ManAHr发酵罐水平表达及发酵条件优化42-49
• 4.1 发酵条件优化简介42
• 4.2 实验材料42
• 4.2.1 实验菌种42
• 4.2.2 实验试剂42
• 4.2.3 常用溶液42
• 4.3 实验仪器42-43
• 4.4 实验方法43-44
• 4.4.1 种子摇瓶培养43
• 4.4.2 发酵罐培养条件优化43-44
• 4.4.3 菌体浓度检测方法44
• 4.4.4 蛋白含量的测定44
• 4.4.5 干热喷雾干燥处理44
• 4.5 结果与分析44-48
• 4.5.1 甘油补料44-46
• 4.5.2 甲醇补料46-47
• 4.5.3 喷雾干燥47-48
• 4.6 本章小结48-49
• 结论49-51
• 参考文献51-55
• 致谢55-56
• 附录56-59
• 研究生期间发表的文章59

本文编号：614585