基于高荧光碳点的免疫荧光探针的构建及其在微生物检测中的应用研究

发布时间：2017-08-07 01:01

  本文关键词：基于高荧光碳点的免疫荧光探针的构建及其在微生物检测中的应用研究

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【摘要】：目的:以柠檬酸为碳源,采用微波加热一步法,制备表面经钝化剂修饰的荧光碳点,通过优化制备过程和反应条件,达到高荧光量子产率,并研究其发光机理。将碳点作为荧光标记物和大肠杆菌抗体分子结合,构建免疫荧光探针,以肠出血性大肠杆菌O157:H7为目标检测物,利用抗体-抗原特异性结合特性,观察大肠杆菌样本与探针结合后的荧光性,验证碳点在免疫荧光探针的构建是否成功,探索碳点基免疫荧光探针在大肠杆菌检测中的应用。期望制备一种低毒、经济、高效、稳定的碳点作为免疫荧光探针的荧光标记物,安全、高效地识别目标检测物。内容与方法:本论文拟在以下几个方面开展工作:(1)选择无水柠檬酸为碳源,聚乙烯亚胺(PEI)为修饰剂,通过微波法直接合成表面氨基化的碳点,无需再进行表面修饰,合成荧光性能良好的荧光碳点;系统研究微波时间、反应物配比等合成条件对碳点的产率、结构、组成、微观形貌、粒径大小及其分布的影响,揭示碳点的形成规律,进行透射电镜(TEM)、红外光谱(FTIR)、荧光光谱(FL)、紫外吸收光谱(UV)等表征手段,分析其成分、结构、形貌特征。(2)将碳点与大肠杆菌抗体通过酰胺化反应化学偶联,形成免疫荧光探针;选择与大肠杆菌类似的其他细菌作为对照模型,分析碳点与对照模型之间、免疫荧光探针与对照模型之间的相互作用及非特异吸附性能,研究免疫荧光探针的专一性。(3)探索基于碳点的免疫荧光探针在大肠杆菌检测中的应用,建立大肠杆菌浓度与探针荧光强度之间的关系,确定检测限。结果:(1)通过实验证明了PEI修饰的碳点荧光强度比无PEI修饰的碳点明显增强,同时增加了碳点表面的氨基功能基团,使未来免疫荧光探针的构建提供了基础。表征结果显示,碳点呈球形,粒径分布范围窄,平均粒径3 nm,小于10 nm,粒径小可以尽可能的减小对生物的干扰。碳点的荧光性能优良,荧光量子产率达到了46.7%,略低于作为标准物的硫酸奎宁(荧光量子产率为54%),达到了较高的荧光量子产率。而且光稳定性强,可长时间保持稳定的荧光强度。激发波长为360 nm时,具有最强的荧光发射峰,在440 nm左右。合成的碳点具有随着激发波长的红移,发射波长也随之红移的现象,在紫外光激发下发射蓝色荧光,在蓝色光激发下发射绿色荧光,在绿色光激发下发射红色荧光,因此可用于多色荧光成像。实验对制备碳点过程中的原料配比、pH、微波时间等实验条件进行了优化,碳点的最优合成条件是无水柠檬酸和聚乙烯亚胺配比3:1,并且此时的溶液pH值为5,呈弱酸性,微波时间为10 min。获得的碳点粒径均匀,分布范围窄,并且荧光性能优良。(2)通过碳点与E.coli O157:H7孵育,利用粒径小的优势,通过细菌的内吞作用,碳点进入到了细菌的内部,实现了对E.coli O157:H7的荧光标记和成像,说明了碳点具有好的生物相容性,能够穿透细胞壁进入细菌内部。此外,碳点对E.coli O157:H7的荧光标记,可以产生多色荧光,在紫外、蓝色和绿色光激发下,细菌呈现蓝色、绿色和红色荧光图像。在未来的荧光成像应用中,我们可以采用波长较长的激发光源,减少目标标记物自体荧光的干扰。采用MTT法测定了碳点的细胞毒性,结果表明即使在我们实验所用最高浓度1.2mg/mL时,细胞仍然具有80%以上的存活率,充分表明碳点的低细胞毒性的优点。(3)通过EDC/NHS偶联法将氨基修饰的碳点和抗体共价结合,构建了一种基于碳点的免疫荧光探针,使碳点这种新型的荧光纳米材料成功应用在了荧光抗体技术中。能够在较短时间内特异性的识别E.coli O157:H7,并且多色荧光成像。我们基于碳点构建的免疫荧光探针能够快速的检测样本中的E.coli O157:H7,检测灵敏度达到103CFU/mL,并可在短时间内(1 h)完成,可通过便携式光谱仪实现野外环境下的快速侦检。结论:我们成功制备了一种较高荧光量子产率的碳点,比将其应用到了荧光抗体技术中,构建了免疫荧光探针,特异性地识别了E.coli O157:H7,并达到了较高的灵敏度。我们相信,在目前的不足和问题解决之后,碳点作为一种新型的荧光纳米材料,在荧光免疫技术中的应用一定会得到极大地推动,有望成为具有自主知识产权的新型低毒生物传感器,拓展至病毒和其他细菌微生物的检测,在理论和实际应用中具有重要的价值。
【关键词】：荧光抗体技术 免疫荧光探针 碳点 特异性 大肠杆菌O157:H7
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.6
【目录】：

• 缩略词表7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 绪论13-30
• 1.1 前言13-14
• 1.2 荧光碳点的概述14
• 1.3 碳点的制备14-19
• 1.3.1 自上而下法14-16
• 1.3.2 自下而上法16-19
• 1.4 碳点的性能19-21
• 1.4.1 结构特性19
• 1.4.2 光学特性19-21
• 1.4.3 碳点的毒性和生物相容性21
• 1.5 碳点的应用21-26
• 1.5.1 环境检测21-23
• 1.5.2 生物成像23-24
• 1.5.3 光催化应用24-25
• 1.5.4 其他应用25-26
• 1.6 荧光抗体技术26-28
• 1.6.1 荧光抗体技术发展现状26-27
• 1.6.2 碳点在荧光抗体技术中的应用27-28
• 1.7 课题研究主要内容28-30
• 第二章 微波法制备荧光碳点30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 实验仪器30-31
• 2.3 实验试剂和材料31
• 2.4 实验方法31-33
• 2.4.1 碳点的制备31-32
• 2.4.2 碳点的表征32-33
• 2.5 结果与讨论33-42
• 2.5.1 碳点的结构表征33-34
• 2.5.2 碳点的红外光谱表征34-35
• 2.5.3 碳点的紫外吸收光谱和荧光性能35-39
• 2.5.4 碳点性能影响因素39-42
• 2.6 本章小结42-44
• 第三章 碳点的细菌荧光成像和细胞毒性44-49
• 3.1 引言44
• 3.2 实验仪器44-45
• 3.3 实验试剂和材料45
• 3.4 实验方法45-46
• 3.4.1 E.coli O157:H7的培养45-46
• 3.4.2 碳点对E.coli O157:H7的荧光成像46
• 3.4.3 MTT细胞毒性评价46
• 3.5 结果与讨论46-48
• 3.5.1 碳点标记E.coli O157:H7的荧光成像46-48
• 3.5.2 碳点的细胞毒性48
• 3.6 本章小结48-49
• 第四章 免疫荧光探针的构建及E.coli O157:H7的特异性识别与检测49-58
• 4.1 引言49-50
• 4.2 实验仪器50
• 4.3 实验试剂和材料50-51
• 4.4 实验方法51-53
• 4.4.1 免疫荧光探针的构建51-52
• 4.4.2 E.coli O157:H7的培养52
• 4.4.3 E.coli O157:H7的特异性识别52
• 4.4.4 E.coli O157:H7的浓度检测52-53
• 4.5 结果与讨论53-56
• 4.5.1 构建的免疫荧光探针53-54
• 4.5.2 C-Abs对E.coli O157:H7的特异性识别54
• 4.5.3 C-Abs对E.coli O157:H7的浓度检测54-56
• 4.6 本章小结56-58
• 第五章 总结与展望58-60
• 参考文献60-68
• 在学期间取得的成果及发表的代表性论著68-69
• 作者简历69-70
• 致谢70-71

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