Cry1A类蛋白交换结构域对杀虫活性影响的研究

发布时间：2017-08-13 00:22

  本文关键词：Cry1A类蛋白交换结构域对杀虫活性影响的研究

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【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种广泛分布的革兰氏阳性细菌,在形成芽胞的同时能产生由cry或cyt基因编码的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),对多种害虫有特异杀虫活性。目前,Bt不仅被开发成生物农药在害虫防治中得到应用,表达Bt Cry蛋白的转基因抗虫植物也已经被广泛种植,带来了巨大的经济效益与生态效益。其中Cry1A是一个对鳞翅目害虫有高活性的杀虫蛋白家族,目前已知的Cry1A类基因有10个模式种类,112个杀虫基因。这些基因中cry1Ab、cry1Ac应用最为广泛,cry1Ah基因是中国农业科学院植物保护研究所克隆的具有自主知识产权的杀虫基因,其编码的Cry1Ah蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis)和水稻二化螟(Chilo suppressalis)等多种鳞翅目害虫具有很高的毒杀活性,超过目前商业化的cry1Ab、cry1Ac等基因,具有巨大的应用前景,目前正在进行转基因抗虫植物研究。对目前已经明确杀虫活性蛋白的各结构域进行序列比对聚类发现,部分杀虫活性(特别是Cry1类蛋白)可以由结构域III的重组获得,Cry毒素结构域交换是一种杀虫特异性进化的机制。通过序列比对发现,Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三个蛋白之间有共同的结构域II;Cry1Ab、Cry1Ac有共同的结构域I;而Cry1Ac、Cry1Ah有共同的结构域III。Cry1Ab结构域III与Cry1Ac、Cry1Ah不同,但是在Cry1A家族中比较常见,与Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af等蛋白结构域III序列一致性大于97%;Cry1Ah结构域I比较独特,不仅与Cry1Ab、Cry1Ac不同,与所有报道的Bt杀虫蛋白的结构域I差异都较大。本研究通过同源建模的方法比较了Cry1Ab,Cry1Ah结构域I结构、表面电荷分布特点;进一步构建了编码cry1Ah与cry1Ab、cry1Ca杂合基因;并对部分杂合基因进行了表达与功能研究,取得结果如下。利用SWISS-MODEL建模分别获得了Cry1Ah1与Cry1Ab13结构域I以及三个结构域核心活性区的机构信息,通过分子叠合比对发现,尽管Cry1Ah1与Cry1Ab13序列存在较大差异(31%),但是两者结构域I的碳骨架没有差异。进一步分析了结构域I的表面结构与表面静电势分布,结果显示尽管两个蛋白结构域I的碳骨架没有差异,由于氨基酸序列以及氨基酸侧链基团不同,两个蛋白的结构表面以及电势分布都有所不同。通无缝克隆方法,构建了4种杂合基因;AhAhCa含有Cry1Ah结构域I、II和Cry1Ca结构域III;p ET-AHAHAB含有Cry1Ah结构域I、II和Cry1Ab结构域III;AhAbAb含有Cry1Ah结构域I和Cry1Ab结构域II、III;PET-AHCACA含有Cry1Ah结构域I和Cry1Ca结构域II、III。成功表达了Cry1Ab、Cry1Ah的杂合蛋白p ET-AHAHAB并测定了杀虫活性,结果显示结构域交换引起蛋白杀虫谱的显著变化。这些数据表明,3D-Cry蛋白杀虫特异性可能不仅和结构域II、结构域III有关,还有可能与包括结构域I在内的三个结构域的组合有关。3D-Cry蛋白中3个结构域两两之间都有接触,包括结构域I在内的不同的结构域组合都会影响蛋白结构表面微环境的变化,这些变化可能会对Cry蛋白的性质产生影响。进一步分析杂合蛋白杀虫特异性变化的原因对进一步揭示3D-Cry蛋白杀虫特异性进化机制有重要意义。
【关键词】：苏云金芽胞杆菌 结构与功能 pET-AHAHCA pET-AHAHAB
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S482.39
【目录】：

• 摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-28
• 1.1 苏云金芽胞杆菌13
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白13-23
• 1.2.1 Cry蛋白13-14
• 1.2.2 Cry蛋白命名14-15
• 1.2.3 Cry蛋白作用机制15
• 1.2.4 Cry蛋白结构15-21
• 1.2.5 Cry蛋白的进化21-23
• 1.3 Cry1Ah蛋白23-24
• 1.4 Cry1Ab蛋白24-25
• 1.5 Cry1Ca蛋白25-27
• 1.6 本研究的目的与意义27
• 1.7 立题依据27-28
• 2 材料与方法28-36
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 供试菌株和质粒28
• 2.1.2 引物合成及序列测定28-29
• 2.1.3 抗生素29
• 2.1.4 培养基29
• 2.1.5 核酸电泳试剂29
• 2.1.6 E.coli质粒DNA提取29-30
• 2.1.7 生化试剂和酶30
• 2.1.8 标准分子量30
• 2.1.9 SDS - PAGE试剂30
• 2.1.10其他试剂30-31
• 2.2 仪器设备31
• 2.3 供试昆虫31
• 2.4 试验方法31-34
• 2.4.1 大肠杆菌质粒提取31-32
• 2.4.2 PCR扩增程序32
• 2.4.3 重叠PCR扩增32
• 2.4.4 转化32-33
• 2.4.5 基因鉴定33
• 2.4.6 序列的测定及分析33
• 2.4.7 杂合蛋白表达33-34
• 2.5 蛋白电泳检测34
• 2.6 杀虫活性测定34-36
• 2.6.1 小菜蛾生物活性测定34-35
• 2.6.2 玉米螟生物活性测定35
• 2.6.3 甜菜夜蛾、棉铃虫的生物活性测定35
• 2.6.4.猿叶甲生物活性测定35-36
• 3 结果与分析36-55
• 3.1 pET-AHAHAB构建36-42
• 3.1.1 Cry1Ah与Cry1Ab、pET-AHAHAB序列比较36
• 3.1.2 Cry1Ah与Cry1Ab结构域I比较36-37
• 3.1.3 Cry1Ah与Cry1Ab杂合蛋白构建37-38
• 3.1.4 pET-AHAHAB蛋白定量结果38-39
• 3.1.5 pET-AHAHAB生物活性测定39-42
• 3.2 AhAhCa构建42-47
• 3.2.1 Cry1Ah1与Cry1Ca7、AhAhCa序列比较42-43
• 3.2.2 Cry1Ah与Cry1Ca结构域I比较43-44
• 3.2.3 Cry1Ah与Cry1Ca杂合蛋白构建44
• 3.2.4 构建杂合蛋白测序结果44-45
• 3.2.5 AhAhCa蛋白定量结果45
• 3.2.6 AhAhCa生物活性测定45-47
• 3.3 AhAb Ab构建47-50
• 3.3.1 Cry1Ah与Cry1Ab、AhAbAb序列比较47
• 3.3.2 Cry1Ah与Cry1Ab杂合蛋白构建47-48
• 3.3.3 cry1Ah和cry1Ab13 PCR扩增产物48
• 3.3.4 AhAbAb酶切鉴定结果48
• 3.3.5 AhAbAb转Rosetta PCR鉴定结果48-49
• 3.3.6 AhAbAb蛋白表达49
• 3.3.7 p ET-AHABAB 生物活性测定49-50
• 3.4 pET-AHCACA构建50-55
• 3.4.1 Cry1Ah与Cry1Ca、pET-AHCACA序列比较50-51
• 3.4.2 cry1Ah和cry1Ca7 PCR扩增产物51
• 3.4.3 p ET-AHCACA酶切鉴定结果51-52
• 3.4.4 pET-AHCACA转Rosetta PCR鉴定结果52
• 3.4.5 pET-AHCACA表达52-53
• 3.4.6 pET-AHCACA生物活性测定53-55
• 4 讨论55-57
• 5 结论57-58
• 致谢58-60
• 参考文献60-66
• 附录66-67
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文67

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 代平礼;转Bt cry1Ah基因玉米对蜜蜂的安全性研究[D];中国农业科学院;2011年

2 岳同卿;转Bt Cry1 Ah基因抗虫玉米的研究[D];中国农业科学院;2009年

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本文编号：664439