斑马鱼活性Tc1转座子的挖掘及验证

发布时间：2017-09-02 02:34

  本文关键词：斑马鱼活性Tc1转座子的挖掘及验证

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【摘要】：转座子广泛分布于细菌、真菌及昆虫等各种生物中,是一种可以在基因组内移动的DNA元件,在转基因和基因治疗等领域具有很好的应用前景。目前国际上转座子的研发和应用研究取得显著进展,女PB、SB、Tol2等转座子已经作为基因治疗和转基因的介导载体得到广泛应用,但国内自主知识产权的转座子研发相对滞后。本研究通过斑马鱼基因组上DNA转座子挖掘,并经过脊椎动物细胞和胚胎水平验证,获得高活性ZB转座子,为动物转基因、功能基因组学(基因捕获等)和基因治疗等研究提供具有自主知识产权的遗传操作工具。主要研究内容如下：(1)通过生物信息学分析,在斑马鱼基因组中发现5个结构完整的Tc1/Mariner家族DNA转座子。遗传分化比较表明,其中1个转座子活性最强,是年轻转座子,命名为ZB。完整ZB转座子全长1.4kb,两端各有一个对称的203bp的末端反向重复序列,中间含有1026bp的转座酶基因编码序列。斑马鱼基因组中至少存在21个ZB拷贝,其中16个为完整的拷贝,DNA序列和ORF的氨基酸序列的同源性分别为99.80%和99.47%。ZB两端的TIR序列相似性达100%。其ORF含有Tcl转座子典型的保守结构域(如HTH、NLS、DD34E等)。(2)经过qPCR和原位杂交检测表明,ZB转座酶的正反转录子在斑马鱼在所检测的11阶段都有表达,且表达强度随着时间的增加而升高。在成年斑马鱼大脑、心脏、肌肉、睾丸和卵巢组织中表达存在差异,且在大脑中表达量最高,在心脏、睾丸和卵巢组织较低。(3)为验证ZB在哺乳动物细胞上的活性,克隆ZB转座子的上下游TIR转座元件和转座酶ORF,分别构建成框架载体pZB-Msc和转座酶辅助质粒(pCMV-ZB)。再将含有新霉素性基因表达盒(PGK-NEO)克隆至转座子框架载体pZB-Msc,形成转座子供体质粒pZB-PGK-NEO,然后将转座子(pZB-PGK-NEO)和转座酶以不同质量比共转染Hela细胞,并与PB、SB和To12转座子进行比较。试验结果表明4种转座子实验组表达新霉素抗性基因的细胞数量均高于对照组,且ZB转座子体统在1：1质量比时含抗性的细胞数量最多,即转座效率最高。ZB在10：1,2：1,1：1,1：2质量比时,抗性细胞数量高于SB转座子,且在1：1时差异明显(P0.01)。ZB的转座效率可以与PB媲美,高于SB和TOL2(P0.05)。(4)为验证ZB在斑马鱼胚胎上的转座活性,将含有鲤鱼beta-actin启动子和GFP基因的绿色荧光蛋白表达盒(FAG-GFP)分别克隆至转座子框架载体pZB-Msc,形成转座子供体质粒,然后将转座子(含FAG-GFP表达盒)和转座酶mRNA共注射斑马鱼一细胞期胚胎,注射后观察荧光,比较4种转座子的转座效率,试验结果表明,在注射后24hpf和5dpf的GFP阳性率ZB转座子均高于其它3种转座子,且显著高于SB转座子(P0.05)。(5)为验证ZB在小鼠胚胎上的转座活性,将含有鸡beta-actin启动子和GFP基因的绿色荧光蛋白表达盒(CAG-GFP)克隆至转座子框架载体pZB-Msc,形成转座子供体质粒,然后将转座子(含CAG-GFP表达盒)和转座酶共注射小鼠受精卵,注射后胚胎发育至囊胚期观察荧光,每组重复三次,试验结果显示3组胚胎均有荧光,加转座酶质粒组、转座酶mRNA组和未加转座酶组的胚胎阳性率分别为31.76%(n=110)、33.43%(n=147)和4.34%(n=162),加转座酶组的胚胎阳性率均显著高于未加转座酶组(P0.05),加转座酶组的胚胎阳性率之间差异不显著(P0.05)。本研究表明,新发现的ZB转座子是高活性转座子,该转座子能够在哺乳动物细胞、小鼠胚胎和斑马鱼胚胎上高效介导外源基因转移,在转基因动物制备和基因治疗中具有较好的应用前景。
【关键词】：转座子 转基因 转座活性 斑马鱼 小鼠 基因治疗
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 英文缩略词11-12
• 前言12-13
• 第一篇 文献综述 Tc1/Mariner超家族的研究进展13-26
• 1 Tc1/Mariner转座子结构14-15
• 2 Tc1/Mariner的转座机制15-16
• 3 Tc1/Mariner转座子超家族的分类及分布16-18
• 4 活性Tc1/Mariner转座子的挖掘及活性验证18-20
• 5 Tc1/Mariner转座子应用研究现状20-26
• 5.1 转基因21-22
• 5.2 基因捕获22-25
• 5.3 基因治疗25-26
• 第二篇 试验研究26-64
• 第一章 斑马鱼Tc1转座子家族生物信息学分析26-35
• 1 材料与方法26-27
• 1.1 Tc1转座子的挖掘26-27
• 1.2 进化树构建27
• 1.3 系统发育分析27
• 2 结果27-34
• 2.1 斑马鱼Tc1成员及构成27-29
• 2.2 斑马鱼Tc1转座子活性比较29-30
• 2.3 斑马鱼Tc1-c转座子活性预测30-34
• 3 讨论34-35
• 第二章 斑马鱼ZB转座子的时空表达特性35-45
• 1 材料与方法35-40
• 1.1 实验材料35-36
• 1.2 实验方法36-40
• 2 结果40-44
• 2.1 斑马鱼ZB转座酶mRNA的时空表达谱40-41
• 2.2 斑马鱼早期胚胎中表达ZB转座酶RNA原位杂交结果41-44
• 3 讨论44-45
• 第三章 细胞水平活性验证45-55
• 1 材料与方法45-49
• 1.1 菌株及试剂45
• 1.2 载体构建所用引物的设计与合成45-46
• 1.3 转座子供体pZB-Msc的构建46-47
• 1.4 转座酶表达载体pCMV-ZB的构建47-48
• 1.5 pZB-PGK-NEO载体构建48
• 1.6 细胞水平验证(Hela)ZB转座活性48-49
• 2 结果49-54
• 2.1 ZB转座元件的克隆与鉴定49-50
• 2.2 pZB-Msc载体的构建与鉴定50
• 2.3 ZB转座酶辅助质粒的构建与鉴定50-51
• 2.4 PGK-NEO-bGHpA的克隆及鉴定51-52
• 2.5 细胞水平验证ZB转座活性52-54
• 3 讨论54-55
• 第四章 胚胎水平活性验证55-64
• 1 材料与方法55-58
• 1.1 菌株及试剂55
• 1.2 转座酶体外转录辅助质粒pTNT-ZB的构建55-56
• 1.3 转座子载体pZB-CAG-GFP的构建56
• 1.4 转座子载体pZB-FAG-GFP的构建56-57
• 1.5 体外转录制备转座酶mRNA57
• 1.6 斑马鱼胚胎水平验证ZB转座活性57-58
• 1.7 小鼠胚胎水平验证ZB转座活性58
• 2 结果58-62
• 2.1 pTNT-ZB载体的构建与鉴定58-59
• 2.2 pZB-CAG-GFP载体的构建与鉴定59
• 2.3 pZB-FAG-GFP载体的构建与鉴定59-60
• 2.4 ZB-mRNA制备与鉴定60
• 2.5 斑马鱼胚胎水平验证ZB转座活性60-62
• 2.6 小鼠胚胎水平验证ZB转座活性62
• 3 讨论62-64
• 全文结论64-65
• 参考文献(References)65-73
• 致谢73-74
• 攻读学位期间发表学术论文74-75

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