新型双歧杆菌细菌素bifidocin A的提纯、特性及分子结构研究

发布时间：2017-09-19 10:29

  本文关键词：新型双歧杆菌细菌素bifidocin A的提纯、特性及分子结构研究

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【摘要】：细菌素作为一种天然生物防腐剂,无毒、无残留、绿色安全,目前研究显示乳酸菌是细菌素的巨大来源库,而关于人体肠道重要优势菌群双歧杆菌所产细菌素的报道非常有限。本课题拟筛选得到一株有自主知识产权的产细菌素双歧杆菌优良菌株,优化其产细菌素的发酵条件,建立快速有效的提取纯化方法,并对其理化及生物学特性和分子结构进行初探。所得主要研究结果与结论如下:(1)成功从母乳婴儿源粪便样品中分离出一株具有显著抑菌作用的双歧杆菌优良菌株,经鉴定其为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis),命名为BB04,排除各种干扰因素后确定其所产抑菌物质为细菌素,并将其命名为bifidocin A。(2)通过单因素及响应面法优化,得到双歧杆菌代谢产细菌素bifidocin A的最佳条件为:发酵时间40.28(40.5)h,发酵温度34.55(35)℃,发酵起始pH6.75。利用此条件发酵双歧杆菌BB04,所产细菌素效价可达到787.3 AU/m L,是优化前的1.3倍。(3)基于细菌素的阳离子和疏水特性,建立了双歧杆菌细菌素bifidocin A的四步提取纯化方法:硫酸铵盐析--SP Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱--葡聚糖凝胶G-10层析色谱--C18反相高效液相色谱。纯化后得到的细菌素比活力高达5535 AU/mg,纯化倍数达到115倍。(4)特性试验结果显示:双歧杆菌细菌素bifidocin A可在50-100℃处理30min后保留70%以上活性,121℃加热20min活性残留50%以上;在pH3.0-8.0范围比较稳定,活性可保留60%以上,pH2.0环境中只能发挥30%的抑菌作用,pH11.0使其完全失活;对蛋白酶K、酸性蛋白酶和胃蛋白酶十分敏感,胰蛋白酶和中性蛋白酶可使其部分失活;该细菌素有较宽抑菌谱,可抑制多种G+菌、G-菌、真菌,尤其大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌、丁酸梭菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、热死环丝菌、酵母菌等。同时,确定细菌素bifidocin A的作用方式为短时间迅速杀菌,其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为640AU/mL和2560AU/m L。此外,细菌素对指示菌细胞吸附效果受温度和时间影响较小,受pH和盐离子浓度影响较大。(5)分子结构测定结果可知:双歧杆菌细菌素bifidocin A的分子量为1198.7Da;N端前10个氨基酸序列为Val Phe His Pro Gly Thr Gly Pro Pro Gly(VFHPGTGPPG),推测未测出的氨基酸可能是Asp(D)和Leu(L);bifidocin A二级结构主要为含量58%以上的无规则卷曲结构、27%左右的β折叠结构和12%左右的β转角,且其在亲水环境和疏水环境中结构无明显变化,是一种非规则蛋白三级结构的新型三级结构。综上所述,研究所得双歧杆菌BB04为国内外首次报道产细菌素动物双歧杆菌菌株,该菌株所产细菌素bifidocin A不仅抑菌谱广、抑菌活性强、安全性高,而且具有很好的食品加工特性,有作为天然食品防腐剂的巨大应用前景。
【关键词】：双歧杆菌 细菌素 提纯 特性 分子结构
【学位授予单位】：北京工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 绪论11-19
• 1.1 研究背景11-15
• 1.1.1 天然食品防腐剂11-12
• 1.1.2 乳酸菌细菌素12-15
• 1.1.2.1 乳酸菌细菌素结构12
• 1.1.2.2 乳酸菌细菌素生物合成12-13
• 1.1.2.3 乳酸菌细菌素特性13-14
• 1.1.2.4 乳酸菌细菌素作用机制14
• 1.1.2.5 乳酸菌细菌素在食品中的应用14-15
• 1.2 研究现状15-18
• 1.2.1 双歧杆菌细菌素的产生及特性16-17
• 1.2.2 双歧杆菌细菌素的提取纯化17-18
• 1.2.3 双歧杆菌细菌素的结构18
• 1.3 本课题研究目的及任务18-19
• 第2章 产细菌素优良双歧杆菌的筛选19-30
• 2.1 试验材料与方法19-25
• 2.1.1 试验材料19-20
• 2.1.1.1 菌种取材样品19
• 2.1.1.2 指示菌19
• 2.1.1.3 培养基19
• 2.1.1.4 药品试剂19-20
• 2.1.1.5 仪器设备20
• 2.1.2 试验方法20-25
• 2.1.2.1 双歧杆菌的筛选21-22
• 2.1.2.2 产细菌素双歧杆菌菌株的筛选22
• 2.1.2.3 产细菌素的初步鉴定22-23
• 2.1.2.4 产细菌素优良双歧杆菌菌株的鉴定23-24
• 2.1.2.5 细菌素效价分析24-25
• 2.2 试验结果与分析25-28
• 2.2.1 双歧杆菌的筛选25
• 2.2.2 产细菌素双歧杆菌菌株的筛选25
• 2.2.3 产细菌素的初步鉴定25-26
• 2.2.3.1 产细菌素双歧杆菌优良菌株的复筛25-26
• 2.2.3.2 双歧杆菌产细菌素的鉴定26
• 2.2.4 产细菌素优良双歧杆菌菌株BB04的鉴定26-28
• 2.2.4.1 形态学观察26-27
• 2.2.4.2 生理生化检验27
• 2.2.4.3 16S rDNA基因序列分析及系统发育树构建27-28
• 2.2.5 细菌素效价分析标准曲线28
• 2.3 讨论28-29
• 2.4 结论29-30
• 第3章 双歧杆菌产bifidocin A的发酵条件优化30-40
• 3.1 材料与方法30-32
• 3.1.1 试验材料30-31
• 3.1.1.1 菌株和培养基30
• 3.1.1.2 药品试剂30
• 3.1.1.3 仪器设备30-31
• 3.1.2 试验方法31-32
• 3.1.2.1 抑菌试验方法31
• 3.1.2.2 双歧杆菌代谢产bifidocin A的最适发酵条件的确定31-32
• 3.2 试验结果与分析32-39
• 3.2.1 单因素试验结果32-36
• 3.2.1.1 双歧杆菌BB04的生长曲线及其抑菌活性曲线32-33
• 3.2.1.2 接种量对双歧杆菌BB04代谢产bifidocin A的影响33
• 3.2.1.3 起始pH对双歧杆菌BB04代谢产bifidocin A的影响33-34
• 3.2.1.4 培养温度对双歧杆菌BB04代谢产bifidocin A的影响34-35
• 3.2.1.5 促双歧因子对双歧杆菌BB04代谢产bifidocin A的影响35-36
• 3.2.2 响应面优化双歧杆菌BB04代谢产bifidocin A发酵条件36-39
• 3.3 讨论39
• 3.4 结论39-40
• 第4章 双歧杆菌细菌素bifidocin A的提取纯化40-49
• 4.1 试验材料与方法40-43
• 4.1.1 试验材料40-41
• 4.1.1.1 样品40
• 4.1.1.2 指示菌40
• 4.1.1.3 药品试剂40
• 4.1.1.4 仪器设备40-41
• 4.1.2 试验方法41-43
• 4.1.2.1 抑菌实验方法41
• 4.1.2.2 蛋白质浓度测定方法41
• 4.1.2.3 提取纯化程序及方法41-43
• 4.2 实验结果与分析43-47
• 4.2.1 硫酸铵盐析法粗提43
• 4.2.2 阳离子交换色谱43-44
• 4.2.3 葡聚糖凝胶色谱44-45
• 4.2.4 反相高效液相色谱45-47
• 4.3 讨论47
• 4.4 结论47-49
• 第5章 双歧杆菌细菌素bifidocin A的特性研究49-63
• 5.1 材料与方法49-52
• 5.1.1 试验材料49-50
• 5.1.1.1 样品49
• 5.1.1.2 指示菌49
• 5.1.1.3 药品试剂49-50
• 5.1.1.4 仪器设备50
• 5.1.2 试验方法50-52
• 5.1.2.1 抑菌实验方法50
• 5.1.2.2 理化特性研究50-51
• 5.1.2.3 抑菌谱测定51
• 5.1.2.4 作用方式的确定51
• 5.1.2.5 吸附特性研究51-52
• 5.2 试验结果与分析52-60
• 5.2.1 理化特性研究52-55
• 5.2.1.1 热稳定性研究52-53
• 5.2.1.2 酸碱耐受性研究53-54
• 5.2.1.3 蛋白酶敏感性研究54-55
• 5.2.2 抑菌谱55-57
• 5.2.3 作用方式的确定57-58
• 5.2.3.1 作用方式测定57
• 5.2.3.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定57-58
• 5.2.4 吸附特性研究58-60
• 5.2.4.1 温度对bifidocin A吸附特性的影响58
• 5.2.4.2 pH对bifidocin A吸附特性的影响58-59
• 5.2.4.3 时间对bifidocin A吸附特性的影响59-60
• 5.2.4.4 盐离子对bifidocin A吸附特性的影响60
• 5.3 讨论60-61
• 5.4 结论61-63
• 第6章 双歧杆菌细菌素bifidocin A的分子结构初探63-72
• 6.1 材料与方法63-65
• 6.1.1 试验材料63-64
• 6.1.1.1 样品63
• 6.1.1.2 药品试剂63
• 6.1.1.3 仪器设备63-64
• 6.1.2 试验方法64-65
• 6.1.2.1 分子量测定64
• 6.1.2.2 氨基酸组成测定64
• 6.1.2.3 氨基酸序列的测定64-65
• 6.1.2.4 二级结构的测定和三级结构初探65
• 6.2 试验结果与分析65-70
• 6.2.1 分子量测定65-66
• 6.2.2 氨基酸组成测定66
• 6.2.3 氨基酸序列测定66-67
• 6.2.4 二级结构的测定和三级结构初探67-70
• 6.3 讨论70-71
• 6.4 结论71-72
• 第7章 全文总结与展望72-74
• 7.1 全文总结72-73
• 7.2 展望73-74
• 参考文献74-79
• 在学期间发表的学术论文及研究成果79-80
• 致谢80

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