产葡聚糖乳酸菌的筛选诱变及发酵条件优化

发布时间：2017-09-29 01:25

  本文关键词：产葡聚糖乳酸菌的筛选诱变及发酵条件优化

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【摘要】：乳酸菌能够利用外源简单的碳水化合物,分泌多糖到体外,因其产生的胞外多糖或对产品质地和风味产生影响,或具有益生作用而被广泛研究和应用。肠膜明串珠菌是一种能够利用蔗糖,在自身葡聚糖蔗糖酶的催化下合成葡聚糖的乳酸菌,其合成的葡聚糖在食品、医药、化妆品以及生化试剂行业中应用广泛。本研究的主要内容包括:通过分离、筛选和诱变获得具有自主知识产权的能高产葡聚糖的乳酸菌菌株;进一步研究所获得乳酸菌的葡聚糖蔗糖酶的酶学特性;最后,对菌株发酵生产葡聚糖的培养基和发酵参数进行优化。主要得到以下研究结果:(1)从泡菜汁样品中分离并筛选得到一株葡聚糖产量为5.24±0.14g/L的乳酸菌菌株2-17,经生理生化鉴定及16S r DNA序列同源性分析,菌株被鉴定为肠膜明串珠菌肠膜亚种。(2)通过亚硝基胍和紫外复合诱变方法提高该菌株葡聚糖产量,确定最佳复合诱变条件为:菌株在MRS培养基中培养9h,经浓度为0.5mg/m L亚硝基胍处理80min,置于30w紫外灯45cm处照30s。经两轮复合诱变后,得到一突变菌株UN2-18,葡聚糖产量提高至7.54±0.08g/L,较出发菌株提高了43.89%。该突变株连续传十代后,葡聚糖产量仍维持在7.5g/L左右。(3)突变株UN2-18的葡聚糖蔗糖酶的最适反应温度为33℃,在20-30℃,酶活稳定,最适反应pH为5.5,Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活力具有激活作用,低浓度Co2+具有激活作用,高浓度Co2+抑制酶活,Fe2+具有抑制作用。EDTA、尿素对酶的活性有较强的抑制作用。该酶的动力学参数Km为31m M,最大反应速率Vmax为4.5 U/ml。通过SDS-PAGE、原位反应及PAS染色确定该酶分子量大小为178k Da。突变株UN2-18生长和葡聚糖蔗糖酶合成包括以下必要物质:①氨基酸:异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺;②碱基:腺嘌呤、尿嘧啶,③B族维生素:泛酸、烟酸、叶酸、吡哆醛、核黄素、乳清酸、硫辛酸、肌苷、生物素,④无机盐:K2HPO4、Mg Cl2、Mn SO4。(4)以不同水解程度的乳清粉、脱脂乳、豆粕以及不水解的麦麸和玉米浆粉作为氮源,比较它们对菌株葡聚糖产量的影响,发现当10%水解度的豆粕水解物作为氮源时,葡聚糖产量最高,为7.37±0.12g/L。进一步通过单因素和响应面试验设计方法优化培养基组成,确定蔗糖浓度为9.41%,10%水解度的豆粕添加量为2.09%,K2HPO4为2.09%。在此条件下,菌株对蔗糖的转化率最高,为33.81±0.67%,此时,葡聚糖产量为31.8±0.63g/L。(5)使用最优培养基,采用10L发酵罐发酵,优化发酵条件,得到:发酵温度为28℃,接种量为4%,转速为150r/min,起始p H为6.0,恒p H发酵8h后非恒p H发酵至20h放罐,葡聚糖产量达到34.15±0.27g/L,蔗糖转化效率为36.29%。本研究获得一株具有自主知识产权的产葡聚糖的肠膜明串珠菌肠膜亚种,诱变后葡聚糖合成量达到7.54±0.08g/L,经优化发酵培养基和发酵参数,葡聚糖产量达到34.15±0.27g/L,蔗糖转化效率为36.29%。
【关键词】：明串珠菌 诱变 葡聚糖蔗糖酶 豆粕 响应面 葡聚糖
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-22
• 1.1 立题背景12
• 1.2 文献综述12-20
• 1.2.1 乳酸菌产胞外多糖的特点12-14
• 1.2.2 培养基对胞外多糖合成的影响14
• 1.2.3 培养条件对胞外多糖合成的影响14-15
• 1.2.4 明串珠菌属15-17
• 1.2.5 葡聚糖17-20
• 1.3 本课题的目的和意义20-21
• 1.4 本实验技术路线21-22
• 2 材料与方法22-36
• 2.1 实验材料22-26
• 2.1.1 供试菌株22
• 2.1.2 培养基22-24
• 2.1.3 主要溶液与缓冲液24-25
• 2.1.4 主要试剂及来源25
• 2.1.5 仪器与设备25-26
• 2.2 实验方法26-36
• 2.2.1 产葡聚糖乳酸菌的筛选26-27
• 2.2.2 分离株的鉴定27-29
• 2.2.3 产葡聚糖菌株的诱变29-30
• 2.2.4 突变株葡聚糖蔗糖酶的特性30-33
• 2.2.5 菌株发酵产葡聚糖培养基的确定33-34
• 2.2.6 利用发酵罐发酵生产葡聚糖参数的优化34-35
• 2.2.7 数据统计与分析35-36
• 3 结果与分析36-61
• 3.1 产葡聚糖乳酸菌的分离与鉴定36-40
• 3.1.1 产葡聚糖菌株的初筛36
• 3.1.2 产葡聚糖菌株的复筛36-38
• 3.1.3 菌株 2-17的鉴定38-40
• 3.2 肠膜明串珠菌肠膜亚种 2-17的诱变40-43
• 3.2.1 生长曲线40-41
• 3.2.2 亚硝基胍诱变条件的确定41
• 3.2.3 紫外诱变诱变条件的确定41-42
• 3.2.4 亚硝基胍和紫外复合诱变结果42-43
• 3.2.5 突变株的遗传稳定性43
• 3.3 突变株葡聚糖蔗糖酶的酶学特性43-50
• 3.3.1 果糖测定的标准曲线43-44
• 3.3.2 酶的最适温度和热稳定性44
• 3.3.3 酶的最适p H44-45
• 3.3.4 金属离子对酶活力的影响45
• 3.3.5 EDTA和尿素对酶活力的影响45-46
• 3.3.6 酶的动力学常数46-47
• 3.3.7 酶的分子量47
• 3.3.8 菌株生长及产酶必须营养成分的确定47-50
• 3.4 产葡聚糖培养基的确定50-57
• 3.4.1 单因素实验50-53
• 3.4.2 响应面实验53-57
• 3.5 发酵生产葡聚糖的参数优化57-61
• 3.5.1 摇瓶培养与发酵罐非恒p H发酵的效果比较57-58
• 3.5.2 转速的确定58-59
• 3.5.3 发酵p H的确定59
• 3.5.4 发酵温度的确定59-60
• 3.5.5 接种量的确定60-61
• 4 讨论61-65
• 4.1 产葡聚糖乳酸菌存在的生境61
• 4.2 葡聚糖测定方法的选择61
• 4.3 菌株诱变61-62
• 4.4 葡聚糖蔗糖酶的酶学特性62
• 4.5 肠膜明串珠菌生长和葡聚糖蔗糖酶合成的必须物质62-63
• 4.6 产葡聚糖培养基63-64
• 4.7 采用发酵罐发酵肠膜明串珠菌生产葡聚糖64-65
• 5 结论65-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-73
• 附录73-74
• 攻读学位期间发表的学术论文74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 马静,裴家伟,吴荣荣,张柏林;影响乳酸菌胞外多糖产量的因素研究[J];中国乳品工业;2003年05期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 白丽娟;马奶酒乳酸菌胞外多糖生物合成条件的研究[D];内蒙古农业大学;2006年

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本文编号：939210