嵌合南非2型口蹄疫病毒抗原表位PPV VLPs载体疫苗的构建
发布时间：2021-03-21 08:14
口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus,FMDV）分为7个血清型:A、O、C、Asia l、SAT1、2、3。其中,南非型（Southern Africa Territories,SAT）口蹄疫具有明显的地域性,主要集中在撒哈拉沙漠以南,侵害水牛及其他偶蹄动物。近几年的报告表明,中东地区暴发了南非2型口蹄疫（SAT2 FMD）,跨越了长久以来的地域界限,存在进入我国的风险,给我国的养殖业造成了潜在的威胁。我国在SAT2 FMDV方面的研究较少,了解其蛋白结构与抗原表位对研制储备疫苗具有重要意义。本研究参考相关文献,选择了SAT2 FMDV（PAT/1/2012,GenBank:JX014256）结构蛋白VP1上编码的B细胞表位（VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNF GYVTVDK）和T细胞表位（NVQEGRRKHTDVAFLLDRST）,为设计SAT2 FMDV表位疫苗奠定了基础。猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）能导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等。在猪群里的检...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
口蹄疫区域病毒池(OIE/FAO,2018a)
肍MD在一些国家和地区已经被慢慢控制或消灭，控制FMD在全世界范围内取得了很大成果。截至2018年底，OIE182个成员国中，被确认为非免疫无FMD：68个国家；被确认为免疫无FMD：巴拉圭和乌拉圭；被确认为非免疫无FMD地区：阿根廷等11个国家；免疫无FMD地区：土耳其等8个国家的部分地区(FAOetal.,2019)（图1-2）。蒙古、中国和纳米比亚的FMD法定防控方法受到OIE认可(OIE,2018a)。世界范围内FMD防控虽然得到了令人肯定的结果，但是亚洲和非洲的FMD情况较为惨重，一些国家和地区多年未见FMD再次暴发，全球口蹄疫防控仍然道阻且长。图1-2OIE认可为无FMD国家/地区分布(OIE/FAO,2019)Fig.1-2Distributionofcountries/regionswithoutFMDrecognizedbyOIE中国的防控措施以免疫为主，O、A、Asia1型FMD强制免疫，目前得到了显著成效。根据我国农业部第2635号公告(中华人民共和国农业农村部，2018)，发现Asia1型FMD防控措施为强制销毁。统计分析2018年我国通报的FMD数据发现，总共12个省（自治区）共上报27起FMD疫情(孙映雪等，2019)。主要感染动物为牛和猪，分别有16、10起，流行毒株包括O型毒株（O/ME-SA/PanAsia、O/ME-SA/Ind-2001、O/SEA/Mya-98、O/CATHAY）和A型毒株（A/ASIA/Sea-97）。在全球FMD防控策略和《国家口蹄疫防治计划（2016-2020年）》(中华人民共和国农业农村部，2016)的指导下，我国FMD疫情呈散发(孙映雪等，2019)。我国与疫情严重的西亚-中东、东南亚和南亚相邻，近10年外来毒株高频率传入，现阶段我国主要流行毒株均是跨境输入，所以，我国应该对境外毒株流行趋势和传播方向进行随时观测(张永光，2019)。SAT2FMD尚未在中国发生，但是它已经通过地理边界（撒哈拉沙漠）侵入中东，与非洲频繁的贸易也对我国的畜牧业和乳制品的发展构成了威胁，目前存
中国农业科学院硕士学位论文第二章PPVAV30的病毒纯化及形态观察112.2.3PPVAV30病毒纯化（1）配制40%PEG6000溶液。（2）收集病毒上清液：10,000r/min离心25min。（3）沉淀病毒：将40%PEG6000溶液与细胞上清液混合（体积比为1:3），4℃缓慢搅拌12h后，10,000r/min离心60min。（4）PBS重悬病毒：用无菌1×PBS缓冲液重悬病毒沉淀。（5）17%蔗糖垫纯化病毒：向超速离心管底加入4mL17%蔗糖溶液，将病毒液缓慢加入在其上层，30,000r/min超速离心4h。（6）用PBS缓冲液重悬，浸泡过夜后，5000r/min离心20min。（7）将上清分装，-20℃保存待用。2.2.4电镜观察取纯化的PPVAV30病毒10μL滴加到铜网中间，室温下吸附15min后，使用吸水纸从侧面吸去液体风干。再取2%磷钨酸钠溶液10μL染色8min后，使用吸水纸从侧面吸去液体风干。将铜网放置于多孔板中准备透射电镜观察。2.3实验结果2.3.1PPVAV30引起PK-15细胞病变将过滤后的PPVAV30病毒液加入到PK-15细胞中培养，细胞出现明显病变：细胞变圆，聚集，病变细胞脱落，出现空斑，如图2-1示。将病变细胞反复冻融3次，10000r/min离心20min，收集上清，-70℃冻存。图2-1PPVAV30感染PK-15细胞病变情况（400×）Fig.2-1CytopathogeniceffectsofPK-15cellsinfectedwithPPVAV30(400×)（a）：正常培养24h后的PK-15细胞；（b）：PPVAV30感染24h后的PK-15细胞(a):NormalPK-15cellsafterculture24h;(b):PPVAV30InfectedPK-15cellsafter24h2.3.2病毒粒子电镜观察将实验室冻存的PPVAV30细胞毒在流水下融化过滤后，接种到PK-15细胞上培养，稳定传代，显微镜下观察到明显病变，有聚团脱落现象。收集病毒上清纯化后，用透射电镜（Transmission
【参考文献】：
期刊论文
[1]The DEAD-Box RNA Helicase DDX1 Interacts with the Viral Protein 3D and Inhibits Foot-and-Mouth Disease Virus Replication[J]. Qiao Xue,Huisheng Liu,Qiaoying Zeng,Haixue Zheng,Qinghong Xue,Xuepeng Cai. Virologica Sinica. 2019(06)
[2]猪口蹄疫现状与防控[J]. 张永光. 兽医导刊. 2019(19)
[3]2018年全球口蹄疫流行状况分析[J]. 孙映雪,朱琳,陈伟,王梦瑶,彭冬,张秀娟,郑雪光,宋建德. 中国动物检疫. 2019(06)
[4]猪细小病毒病毒样颗粒的体外组装[J]. 宋品,孙世琪,董虎,滕志东,曹随忠,郭慧琛,余树民. 中国兽医科学. 2017(06)
[5]猪口蹄疫疫苗免疫效果临床评价技术及应用[J]. 吕建亮,张永光,杨汉春,童光志,姜平,何启盖,张桂红,张改平,钟土木,赖守勋. 中国畜牧杂志. 2015(20)
[6]猪细小病毒病毒样颗粒疫苗研究进展[J]. 刘运超,陈玉梅,姬鹏超,赵宝磊,王聚财,邓瑞广,张改平. 河南农业科学. 2015(10)
[7]全球口蹄疫流行和防控状况[J]. 宋建德,袁丽萍,秦建国,朱迪国,刘陆世,孙洪涛,孙映雪,魏荣. 中国动物检疫. 2015(08)
[8]2013年全球口蹄疫流行状况[J]. 宋建德,朱迪国,袁丽萍,庞素芬,魏荣. 中国动物检疫. 2014(06)
[9]病毒样颗粒抗原的表达、纯化、组装和鉴定[J]. 于永利. 微生物学免疫学进展. 2014(01)
[10]N端嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达及其免疫原性[J]. 李艳丽,曹轶梅,卢曾军,孙普,李平花,白兴文,付元芳,包慧芳,李冬,刘在新. 中国兽医科学. 2013(09)
硕士论文
[1]嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪细小病毒衣壳蛋白免疫原性研究[D]. 李文丽.甘肃农业大学 2017
[2]展示口蹄疫病毒中和表位的猪细小病毒样颗粒组装[D]. 范朋举.中国农业科学院 2014
[3]嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒衣壳蛋白表达与免疫原性研究[D]. 李艳丽.中国农业科学院 2013
[4]FMDV中和表位在HBc上的展示及其嵌合蛋白在重组腺病毒中的表达[D]. 姜志刚.中国农业科学院 2010
本文编号：3092532
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
口蹄疫区域病毒池(OIE/FAO,2018a)
肍MD在一些国家和地区已经被慢慢控制或消灭，控制FMD在全世界范围内取得了很大成果。截至2018年底，OIE182个成员国中，被确认为非免疫无FMD：68个国家；被确认为免疫无FMD：巴拉圭和乌拉圭；被确认为非免疫无FMD地区：阿根廷等11个国家；免疫无FMD地区：土耳其等8个国家的部分地区(FAOetal.,2019)（图1-2）。蒙古、中国和纳米比亚的FMD法定防控方法受到OIE认可(OIE,2018a)。世界范围内FMD防控虽然得到了令人肯定的结果，但是亚洲和非洲的FMD情况较为惨重，一些国家和地区多年未见FMD再次暴发，全球口蹄疫防控仍然道阻且长。图1-2OIE认可为无FMD国家/地区分布(OIE/FAO,2019)Fig.1-2Distributionofcountries/regionswithoutFMDrecognizedbyOIE中国的防控措施以免疫为主，O、A、Asia1型FMD强制免疫，目前得到了显著成效。根据我国农业部第2635号公告(中华人民共和国农业农村部，2018)，发现Asia1型FMD防控措施为强制销毁。统计分析2018年我国通报的FMD数据发现，总共12个省（自治区）共上报27起FMD疫情(孙映雪等，2019)。主要感染动物为牛和猪，分别有16、10起，流行毒株包括O型毒株（O/ME-SA/PanAsia、O/ME-SA/Ind-2001、O/SEA/Mya-98、O/CATHAY）和A型毒株（A/ASIA/Sea-97）。在全球FMD防控策略和《国家口蹄疫防治计划（2016-2020年）》(中华人民共和国农业农村部，2016)的指导下，我国FMD疫情呈散发(孙映雪等，2019)。我国与疫情严重的西亚-中东、东南亚和南亚相邻，近10年外来毒株高频率传入，现阶段我国主要流行毒株均是跨境输入，所以，我国应该对境外毒株流行趋势和传播方向进行随时观测(张永光，2019)。SAT2FMD尚未在中国发生，但是它已经通过地理边界（撒哈拉沙漠）侵入中东，与非洲频繁的贸易也对我国的畜牧业和乳制品的发展构成了威胁，目前存
中国农业科学院硕士学位论文第二章PPVAV30的病毒纯化及形态观察112.2.3PPVAV30病毒纯化（1）配制40%PEG6000溶液。（2）收集病毒上清液：10,000r/min离心25min。（3）沉淀病毒：将40%PEG6000溶液与细胞上清液混合（体积比为1:3），4℃缓慢搅拌12h后，10,000r/min离心60min。（4）PBS重悬病毒：用无菌1×PBS缓冲液重悬病毒沉淀。（5）17%蔗糖垫纯化病毒：向超速离心管底加入4mL17%蔗糖溶液，将病毒液缓慢加入在其上层，30,000r/min超速离心4h。（6）用PBS缓冲液重悬，浸泡过夜后，5000r/min离心20min。（7）将上清分装，-20℃保存待用。2.2.4电镜观察取纯化的PPVAV30病毒10μL滴加到铜网中间，室温下吸附15min后，使用吸水纸从侧面吸去液体风干。再取2%磷钨酸钠溶液10μL染色8min后，使用吸水纸从侧面吸去液体风干。将铜网放置于多孔板中准备透射电镜观察。2.3实验结果2.3.1PPVAV30引起PK-15细胞病变将过滤后的PPVAV30病毒液加入到PK-15细胞中培养，细胞出现明显病变：细胞变圆，聚集，病变细胞脱落，出现空斑，如图2-1示。将病变细胞反复冻融3次，10000r/min离心20min，收集上清，-70℃冻存。图2-1PPVAV30感染PK-15细胞病变情况（400×）Fig.2-1CytopathogeniceffectsofPK-15cellsinfectedwithPPVAV30(400×)（a）：正常培养24h后的PK-15细胞；（b）：PPVAV30感染24h后的PK-15细胞(a):NormalPK-15cellsafterculture24h;(b):PPVAV30InfectedPK-15cellsafter24h2.3.2病毒粒子电镜观察将实验室冻存的PPVAV30细胞毒在流水下融化过滤后，接种到PK-15细胞上培养，稳定传代，显微镜下观察到明显病变，有聚团脱落现象。收集病毒上清纯化后，用透射电镜（Transmission
【参考文献】：
期刊论文
[1]The DEAD-Box RNA Helicase DDX1 Interacts with the Viral Protein 3D and Inhibits Foot-and-Mouth Disease Virus Replication[J]. Qiao Xue,Huisheng Liu,Qiaoying Zeng,Haixue Zheng,Qinghong Xue,Xuepeng Cai. Virologica Sinica. 2019(06)
[2]猪口蹄疫现状与防控[J]. 张永光. 兽医导刊. 2019(19)
[3]2018年全球口蹄疫流行状况分析[J]. 孙映雪,朱琳,陈伟,王梦瑶,彭冬,张秀娟,郑雪光,宋建德. 中国动物检疫. 2019(06)
[4]猪细小病毒病毒样颗粒的体外组装[J]. 宋品,孙世琪,董虎,滕志东,曹随忠,郭慧琛,余树民. 中国兽医科学. 2017(06)
[5]猪口蹄疫疫苗免疫效果临床评价技术及应用[J]. 吕建亮,张永光,杨汉春,童光志,姜平,何启盖,张桂红,张改平,钟土木,赖守勋. 中国畜牧杂志. 2015(20)
[6]猪细小病毒病毒样颗粒疫苗研究进展[J]. 刘运超,陈玉梅,姬鹏超,赵宝磊,王聚财,邓瑞广,张改平. 河南农业科学. 2015(10)
[7]全球口蹄疫流行和防控状况[J]. 宋建德,袁丽萍,秦建国,朱迪国,刘陆世,孙洪涛,孙映雪,魏荣. 中国动物检疫. 2015(08)
[8]2013年全球口蹄疫流行状况[J]. 宋建德,朱迪国,袁丽萍,庞素芬,魏荣. 中国动物检疫. 2014(06)
[9]病毒样颗粒抗原的表达、纯化、组装和鉴定[J]. 于永利. 微生物学免疫学进展. 2014(01)
[10]N端嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达及其免疫原性[J]. 李艳丽,曹轶梅,卢曾军,孙普,李平花,白兴文,付元芳,包慧芳,李冬,刘在新. 中国兽医科学. 2013(09)
硕士论文
[1]嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪细小病毒衣壳蛋白免疫原性研究[D]. 李文丽.甘肃农业大学 2017
[2]展示口蹄疫病毒中和表位的猪细小病毒样颗粒组装[D]. 范朋举.中国农业科学院 2014
[3]嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒衣壳蛋白表达与免疫原性研究[D]. 李艳丽.中国农业科学院 2013
[4]FMDV中和表位在HBc上的展示及其嵌合蛋白在重组腺病毒中的表达[D]. 姜志刚.中国农业科学院 2010
本文编号：3092532
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