噬菌体展示技术筛选灵芝8蛋白配体短肽及其活性检测
发布时间：2021-08-14 04:47
灵芝自古便是中国传统医学中的珍贵药材,具有滋补强身、扶正固本之效。在灵芝中提取的一些小分子物质如蛋白质,多糖等也有着免疫调节、抗肿瘤等功效。灵芝蛋白-8（LZ-8）是从灵芝菌丝体中提取出的一种真菌免疫调节蛋白。它的结构与功能与免疫球蛋白相似,具有广泛的免疫调节和抗肿瘤活性。因此,LZ-8可作为一种抗肿瘤药物,有着巨大的研发潜力。由于野生灵芝提取量低等原因,目前LZ-8的制备大多采用基因工程的方法,即重组灵芝-8（rLZ-8）。rLZ-8作为一种基因工程药物,其制备已经日趋成熟,但到目前为止还没有一套标准,快速的检测方法。因此,本文采取噬菌体展示技术筛选rLZ-8配体短肽的方法,建立对rLZ-8蛋白检测的方法,替代单克隆抗体,实现快速,便捷,实时检测rLZ-8,为抗肿瘤药物的检测提供一种新产品和生物学检测方法。本研究首先利用噬菌体展示技术,经过四轮筛选,得到与rLZ-8特异性结合的重组噬菌体。随机挑选克隆子进行ELISA鉴定并提取其ssDNA,进行测序及序列比对,得到一条与rLZ-8特异性结合较强的多肽L-T-P-H-K-H-H-K-H-L-H-A。合成该多肽,并将该多肽分别进行生物素化...
【文章来源】：长春理工大学吉林省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
灵芝免疫调节蛋白（LZ-8蛋白）结构示意图
第一章绪论6肽库筛选技术筛选出rLZ-8蛋白的特异性多肽配体，建立检测rLZ-8蛋白的方法学，替代rLZ-8的单克隆抗体。下面，就对本课题所要应有的主要技术做详细的介绍。1.3噬菌体展示技术的研究进展1.3.1噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)是一种将外源蛋白或多肽与其自身衣壳蛋白进行融合表达并展示在噬菌体表面的技术[37]。这项技术是由美国生物学家SmithGP[38]首次提出的。他将外源的fd基因与丝状噬菌体M13的次要衣壳蛋白pⅢ基因进行连接，得到重组噬菌体，它们进行融合表达，展示在表面，由此建立了这项技术。在1990年，McCafferty[39]利用噬菌体展示技术顺利得到与对应抗原相结合的抗体片段，建立了噬菌体抗体库技术。1996年，生物学者首次应用此技术进行生物体内淘选实验，2018年，此项技术获得了诺贝尔化学奖[40,41]。噬菌体展示技术的主要原理如图1.2所示，首先将靶蛋白分子包被在板上，用构建多样的噬菌体肽库与靶蛋白之间进行共同孵育，洗去未结合的噬菌体，将与之结合下来的噬菌体洗脱下来，将洗脱下来的噬菌体进行扩增。经过3~4轮这样生物淘选的过程，与靶蛋白特异性结合，亲和力高的重组噬菌体就进行了富集。提取出这些噬菌体的DNA，将其进行测序，进一步对其进行深入的研究。外源多肽或蛋白展示在噬菌体的表面,而对应编码的基因作为噬菌体重组基因，可以通过DNA测序而确定出它们的序列。该技术的显著特点就是建立了基因型和表现型之间的相统一的关系[42,43]。图1.2噬菌体展示技术的基本原理流程图
第一章绪论71.3.2丝状噬菌体展示系统目前应用最多的噬菌体展示系统有λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统和丝状噬菌体展示系统[44]。但目前应用最多的是丝状噬菌体展示系统，已开发出商品试剂盒。丝状噬菌体展示系统主要是以噬菌体M13作为主要的展示对象，M13噬菌体的结构如图1.3所示。M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内部含有一个单链的环状ssDNA分子，由6407bp核苷酸组成，其含有噬菌体扩增和单链DNA复制所需要的所有遗传信息[45]。M13是一种溶源性噬菌体，可以侵染大肠杆菌，并利用其ssDNA在大肠杆菌内的滚环复制进行数量上的扩增，且扩增后不会裂解宿主菌，因而可简化后续操作，得到纯化的噬菌体[35]。2012年，陈兴龙[46]等将赭曲霉毒素A(OTA)模拟抗原表位展示在丝状噬菌体的主要蛋白pⅧ表面，获得无毒、容易制备的OTA竞争抗原替代物，建立了检测OTA的ELISA检测方法。2017年，张起莹[47]等利用噬菌体十二肽库筛选技术筛选出与内毒素特异性结合的多肽配体，并建立了增强比浊法来检测内毒素，代替了天然鲎试剂，为内毒素的检测提供了一种检测方法。图1.3所示丝状噬菌体M13结构示意图1.3.3噬菌体展示技术的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]人源抗体制备及临床应用研究进展[J]. 陈秀秀,吴成林,周丽君. 中国生物工程杂志. 2019(10)
[2]灵芝免疫调节蛋白LZ-8及云芝免疫调节蛋白FIP-tvc对几种癌细胞系的抑制活性检测[J]. 王雪妍,周伏忠,向凌云,陈晓飞,宁萌,刁文涛. 河南科学. 2019(06)
[3]生物膜干涉技术在生物分子间相互作用检测中的应用[J]. 张艳,姜丽艳,张晓光,李帅,张爱军,高贵. 生命科学仪器. 2019(02)
[4]双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建及抗GDH纳米抗体筛选[J]. 方媛,徐广贤,王羡,王红霞,潘俊斐. 中国生物工程杂志. 2018(12)
[5]基于噬菌体展示技术抗黄曲霉毒素B1单链抗体的筛选及其蛋白结构分析[J]. 庞倩,陈晶,王小红,王佳. 中国生物工程杂志. 2018(12)
[6]噬菌体展示技术筛选胃癌高表达CD44分子特异性多肽序列的可行性分析[J]. 林小波,贾环,于照祥,李四光,李贞,常伟平. 山东医药. 2018(24)
[7]噬菌体展示技术在多肽类药物开发中的应用[J]. 刘倩倩,夏思远,张舟. 沈阳药科大学学报. 2017(08)
[8]噬菌体抗体库技术概述[J]. 蔡尽忠. 生物学教学. 2017(05)
[9]噬菌体展示技术在抗体药物研发中的应用[J]. 徐梦龙,谭树华. 黑龙江科技信息. 2017(13)
[10]重组FIP的研究进展[J]. 段作文,韩笑,陈丽静,李浩戈,张丽,张良,范文丽,李天来,林景卫. 蔬菜. 2016(09)
博士论文
[1]展示Fba1表位的杂合噬菌体应用于白色念珠菌感染预防和检测的研究[D]. 施洪喜.东北师范大学 2019
[2]LZ8-Fc融合蛋白重组表达及其稳定性研究[D]. 侯玥.吉林大学 2014
[3]蛋白酶缺陷型毕赤酵母重组表达人血白蛋白中试发酵工艺的研究[D]. 李柏志.吉林大学 2012
[4]rlz-8诱导SGC7901细胞自噬性死亡机制的研究[D]. 李泓睿.吉林大学 2011
[5]真菌免疫调节蛋白（FIP）在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的重组表达及其生物学活性的研究[D]. 林景卫.东北师范大学 2009
硕士论文
[1]基于噬菌体展示技术禽流感病毒抗体谱的研究[D]. 田栢会.长春理工大学 2019
[2]基于噬菌体展示技术筛选内毒素结合肽并建立内毒素检测新方法[D]. 张起莹.长春理工大学 2017
[3]重组灵芝免疫调节蛋白进入肝癌细胞内吞机制的研究[D]. 阎明慧.吉林大学 2015
[4]重组灵芝免疫调节蛋白的抗肿瘤作用研究[D]. 宋俐萍.吉林大学 2014
[5]重组真菌免疫调节蛋白基因的表达及抗肿瘤作用初步研究[D]. 丛蔚然.上海交通大学 2014
[6]重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）标准品制备方法的研究[D]. 孙熙麟.吉林大学 2011
[7]重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）免疫调节及抗癌机制初步研究[D]. 李洋.东北师范大学 2010
[8]真菌免疫调节蛋白基因的克隆、优化、功能及多克隆抗体制备[D]. 李奇璋.上海交通大学 2010
[9]重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）发酵及纯化的中试工艺研究[D]. 李柏志.吉林大学 2009
本文编号：3341800
【文章来源】：长春理工大学吉林省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
灵芝免疫调节蛋白（LZ-8蛋白）结构示意图
第一章绪论6肽库筛选技术筛选出rLZ-8蛋白的特异性多肽配体，建立检测rLZ-8蛋白的方法学，替代rLZ-8的单克隆抗体。下面，就对本课题所要应有的主要技术做详细的介绍。1.3噬菌体展示技术的研究进展1.3.1噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)是一种将外源蛋白或多肽与其自身衣壳蛋白进行融合表达并展示在噬菌体表面的技术[37]。这项技术是由美国生物学家SmithGP[38]首次提出的。他将外源的fd基因与丝状噬菌体M13的次要衣壳蛋白pⅢ基因进行连接，得到重组噬菌体，它们进行融合表达，展示在表面，由此建立了这项技术。在1990年，McCafferty[39]利用噬菌体展示技术顺利得到与对应抗原相结合的抗体片段，建立了噬菌体抗体库技术。1996年，生物学者首次应用此技术进行生物体内淘选实验，2018年，此项技术获得了诺贝尔化学奖[40,41]。噬菌体展示技术的主要原理如图1.2所示，首先将靶蛋白分子包被在板上，用构建多样的噬菌体肽库与靶蛋白之间进行共同孵育，洗去未结合的噬菌体，将与之结合下来的噬菌体洗脱下来，将洗脱下来的噬菌体进行扩增。经过3~4轮这样生物淘选的过程，与靶蛋白特异性结合，亲和力高的重组噬菌体就进行了富集。提取出这些噬菌体的DNA，将其进行测序，进一步对其进行深入的研究。外源多肽或蛋白展示在噬菌体的表面,而对应编码的基因作为噬菌体重组基因，可以通过DNA测序而确定出它们的序列。该技术的显著特点就是建立了基因型和表现型之间的相统一的关系[42,43]。图1.2噬菌体展示技术的基本原理流程图
第一章绪论71.3.2丝状噬菌体展示系统目前应用最多的噬菌体展示系统有λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统和丝状噬菌体展示系统[44]。但目前应用最多的是丝状噬菌体展示系统，已开发出商品试剂盒。丝状噬菌体展示系统主要是以噬菌体M13作为主要的展示对象，M13噬菌体的结构如图1.3所示。M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内部含有一个单链的环状ssDNA分子，由6407bp核苷酸组成，其含有噬菌体扩增和单链DNA复制所需要的所有遗传信息[45]。M13是一种溶源性噬菌体，可以侵染大肠杆菌，并利用其ssDNA在大肠杆菌内的滚环复制进行数量上的扩增，且扩增后不会裂解宿主菌，因而可简化后续操作，得到纯化的噬菌体[35]。2012年，陈兴龙[46]等将赭曲霉毒素A(OTA)模拟抗原表位展示在丝状噬菌体的主要蛋白pⅧ表面，获得无毒、容易制备的OTA竞争抗原替代物，建立了检测OTA的ELISA检测方法。2017年，张起莹[47]等利用噬菌体十二肽库筛选技术筛选出与内毒素特异性结合的多肽配体，并建立了增强比浊法来检测内毒素，代替了天然鲎试剂，为内毒素的检测提供了一种检测方法。图1.3所示丝状噬菌体M13结构示意图1.3.3噬菌体展示技术的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]人源抗体制备及临床应用研究进展[J]. 陈秀秀,吴成林,周丽君. 中国生物工程杂志. 2019(10)
[2]灵芝免疫调节蛋白LZ-8及云芝免疫调节蛋白FIP-tvc对几种癌细胞系的抑制活性检测[J]. 王雪妍,周伏忠,向凌云,陈晓飞,宁萌,刁文涛. 河南科学. 2019(06)
[3]生物膜干涉技术在生物分子间相互作用检测中的应用[J]. 张艳,姜丽艳,张晓光,李帅,张爱军,高贵. 生命科学仪器. 2019(02)
[4]双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建及抗GDH纳米抗体筛选[J]. 方媛,徐广贤,王羡,王红霞,潘俊斐. 中国生物工程杂志. 2018(12)
[5]基于噬菌体展示技术抗黄曲霉毒素B1单链抗体的筛选及其蛋白结构分析[J]. 庞倩,陈晶,王小红,王佳. 中国生物工程杂志. 2018(12)
[6]噬菌体展示技术筛选胃癌高表达CD44分子特异性多肽序列的可行性分析[J]. 林小波,贾环,于照祥,李四光,李贞,常伟平. 山东医药. 2018(24)
[7]噬菌体展示技术在多肽类药物开发中的应用[J]. 刘倩倩,夏思远,张舟. 沈阳药科大学学报. 2017(08)
[8]噬菌体抗体库技术概述[J]. 蔡尽忠. 生物学教学. 2017(05)
[9]噬菌体展示技术在抗体药物研发中的应用[J]. 徐梦龙,谭树华. 黑龙江科技信息. 2017(13)
[10]重组FIP的研究进展[J]. 段作文,韩笑,陈丽静,李浩戈,张丽,张良,范文丽,李天来,林景卫. 蔬菜. 2016(09)
博士论文
[1]展示Fba1表位的杂合噬菌体应用于白色念珠菌感染预防和检测的研究[D]. 施洪喜.东北师范大学 2019
[2]LZ8-Fc融合蛋白重组表达及其稳定性研究[D]. 侯玥.吉林大学 2014
[3]蛋白酶缺陷型毕赤酵母重组表达人血白蛋白中试发酵工艺的研究[D]. 李柏志.吉林大学 2012
[4]rlz-8诱导SGC7901细胞自噬性死亡机制的研究[D]. 李泓睿.吉林大学 2011
[5]真菌免疫调节蛋白（FIP）在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的重组表达及其生物学活性的研究[D]. 林景卫.东北师范大学 2009
硕士论文
[1]基于噬菌体展示技术禽流感病毒抗体谱的研究[D]. 田栢会.长春理工大学 2019
[2]基于噬菌体展示技术筛选内毒素结合肽并建立内毒素检测新方法[D]. 张起莹.长春理工大学 2017
[3]重组灵芝免疫调节蛋白进入肝癌细胞内吞机制的研究[D]. 阎明慧.吉林大学 2015
[4]重组灵芝免疫调节蛋白的抗肿瘤作用研究[D]. 宋俐萍.吉林大学 2014
[5]重组真菌免疫调节蛋白基因的表达及抗肿瘤作用初步研究[D]. 丛蔚然.上海交通大学 2014
[6]重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）标准品制备方法的研究[D]. 孙熙麟.吉林大学 2011
[7]重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）免疫调节及抗癌机制初步研究[D]. 李洋.东北师范大学 2010
[8]真菌免疫调节蛋白基因的克隆、优化、功能及多克隆抗体制备[D]. 李奇璋.上海交通大学 2010
[9]重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）发酵及纯化的中试工艺研究[D]. 李柏志.吉林大学 2009
本文编号：3341800
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