中药质量控制相关创新技术研究

发布时间：2018-02-15 08:10

本文关键词： 标准汤剂单分子测序全程质控新型饮片质量追溯中药复方组合全长条形码　出处：《北京中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：中药品质是决定其临床疗效的关键,对其进行质量控制是临床应用的前提。在传统中医药为全世界做出更大贡献的同时,一些质量问题仍在影响其健康发展。例如中成药掺假、夹杂及含有受保护动物制品,饮片形式多种多样而无统一标准,中药材质量参差不齐等。针对以上问题,我们从生产实际出发,期望通过相关环节质量控制技术创新以保证中药品质,并通过质量追溯在整体产业链水平构建品质评价体系,促进各环节的工艺优化和质量控制,保障中药产品质量稳定和疗效可靠。1.中药复方组合全长条形码DNA鉴定研究中成药中的掺假、夹杂,不仅影响临床用药的安全性和有效性,同时因涉及受保护动物而存在监管难题。目前复方鉴定以分子鉴定较准确,其中以依据DNA条形码测序进行鉴定通用性强,但挑克隆一代测序通量低,二代测序读长较短,而长读长、高通量第三代测序技术有望弥补这些不足。通过三代单分子测序,经CCS(Circular Consensus Sequence,环形测序保守序列)处理提高结果Reads质量和准确度,获得全长条形码DNA序列,并使用条形码组合提高鉴定准确性和检出概率。样品经DNA提取,标签引物PCR扩增,磁珠纯化制备建库样本,并上机测序;下机数据经CCS处理,数据抽取获得结果Reads,最后聚类、校验和物种鉴定。以生脉散(由人参、麦冬、五味子构成,比例3:3:2)为例,分别制备散剂、各单味药DNA样本及由单味药DNA混合的DNA样本(混DNA),各DNA样本分别制备ITS2序列和psbA-trnH序列建库样本进行三代测序并进行鉴定分析;并采用ITS2和CO1序列对含动物药的三味蒺藜散(蒺藜,冬葵果,方海)进行鉴定,作为方法验证。同时,通过生脉散ITS2序列挑克隆一代测序进行方法比较分析。结果从生脉散ITS2序列PCR产物中挑取了 81个克隆,其中76个鉴定为人参,5个鉴定为五味子,未检出麦冬。三代测序样本中,除麦冬的ITS2序列建库样本因扩增困难有较多外源序列外,其它样本与预期一致。生脉散ITS2序列建库样本中能检出人参和五味子,psbA-trnH序列建库样本中能检出五味子、麦冬和人参属(Panax sp.)的序列。以其中一份生脉散(SRD-i15/T15)为例,得到890条ITS2结果Reads,其中840条为人参,50条为五味子;得到4443条psbA-trnH结果Reads,其中人参属3429条,五味子986条,麦冬28条。三味蒺藜散中各药味组成都得到鉴定,并检出了 5种外源植物(包括槐Sophora japonica,牛膝Achyranthes bidentata,豇豆 Vignaunguiculata,甘草 Glycyrrhiza uralensis,甘蓝 Brassica oleracea)、2 种外源动物(卷蛾科 Tortricidae sp.,印度谷螟Plodia interpunctella)及 2种微生物的序列,且外源序列Reads数和种类数随测序深度增加而呈现上升趋势。两种散剂共10个混DNA建库样本结果Reads中均无外源物种序列,散剂建库样本中检出的外源物种来源于散剂自身,推断是由于原料不够纯净引入的。三代测序结果Reads总有效率99.93%,大部分样本(39/46)有效率达100%,几乎没有无法解释的结果Reads,平行样本间结果相近,表明该方法稳定可行;即使是原料夹带的外源动植物都能在成药中检出并准确鉴定,且能区分浙麦冬与川麦冬,及与西洋参ITS2序列极相近的人参序列,表明该方法检出限极低、鉴定准确。全长条形码组合的交互验证、互补使鉴定更准确,检出概率更高,选用合适的条形码能拓展用于其它领域的生物检测鉴定。与现有中药复方分子鉴定方法相比,组合全长条形码策略通量较高,流程简单、可批量处理,鉴定更准确,结果更可信。2.中药饮片标准汤剂研究中药新型饮片为临床应用提供便利的同时也存在质量控制难题,包括鉴别困难、质量标准不统一、当量混乱等。参考临床应用汤剂制备方法,兼顾质量控制,以标准化为目的的中药饮片标准汤剂研究,有望为不同形式饮片的鉴别和质量控制提供参考。另外,参照此策略进行中药复方、中药药对规范化研究,能为经典名方、配伍理论等研究提供数据支撑。取符合药典规定,产地、规格等级不同的12批次人参饮片,经标准工艺制备汤剂,从HPLC指纹图谱相似度、出膏率、指标成分含量及转移率等方面对标准汤剂相关参数阈值及质量影响因素进行探讨,制定准入标准,并考察饮片经汤剂制成颗粒过程中的质量传递规律。结果12批次人参饮片标准汤剂的出膏率范围为40.5%～58.8%(为47.2%±5.6%,下同),人参皂苷Rg1+Re和Rb1的转移率分别为57.5%～88.5%(76.0%±9.2%),68.7%～94.8%(80.3%±9.1%),批次间指纹谱图相似度为 0.905～0.997(0.970±0.022),与对照指纹图谱相似度为0.966～0.996(0.986±0.009);。人参饮片标准汤剂准入标准可设定为:Rg1+Re和Rb1的浓度应分别不低于0.529,0.282 g·L-1，，出膏率应不低于40.5%,批次间指纹图谱相似度应不低于0.905,与对照指纹图谱相比应不低于0.966。人参皂苷Rg1+Re每当量含量可用于人参干膏粉、颗粒等质量控制。标准汤剂质量的主要影响因素是药材品质,其中基原和产地是关键。由饮片制得汤剂是质的转移过程,而由汤剂制得颗粒是量变过程,表明标准汤剂(及其煎膏或干膏粉)可作为配方颗粒生产过程中的中间体参照物,以调整投料方案、优化工艺设计,保证与传统饮片煎液质量一致、稳定终产品的生产。鉴于不同形式饮片临床应用多以水溶(煎煮或冲服)为主,与其药效物质基础一致的标准汤剂可作为标准参照物,解决鉴别和质量控制难题。3.中药材质量控制体系探讨全长条形码鉴定对种质不同的浙、川麦冬psbA-trnH序列差异位点进行了验证;人参饮片标准汤剂研究表明药材质量与产地关系密切,而农残超标、炮制不当更是关系到中药的安全性和临床疗效。鉴于中药材质量影响因素较多,需以质量追溯体系为框架、结合环节质控,构建中药材质量控制体系。对现阶段中药材质量追溯体系所面临的问题与挑战进行分析,并提出解决方案,同时结合品质生态学和产地区划研究,以期从产业结构和技术环节上共同为中药材质量控制体系发展献策。分析表明,中药材质量追溯体系完善亟需发展集约化生产,并适当精简产业结构,建设配套仓储、物流设施。以五味子为例,结合其品质影响因素和产地生态因子分析,采用药用植物全球产地生态适宜性区划信息系统(GMPGIS)进行产地适宜性区划,为不同适宜性区域类型的五味子种植选地和生产集约化提供参考,并提出五味子生产质量控制体系框架。4.总结组合全长条形码DNA鉴定提供了中药复方生物组成全面、准确鉴定的新方法,有利于中成药质量控制及动物保护;饮片标准汤剂可作为中间体参照物用于配方颗粒等新型饮片的生产质控,为中药饮片质量控制提供新思路;中药材品质生态学和产地区划研究保障正品药材供应,促进生产集约化和质量追溯体系发展。这些技术方法用于中药材、饮片、中成药等产业链不同阶段质量控制,并通过质量追溯形成完整的信息链条,结合终产品品质评价,促进质量形式转变过程(种植、采收、加工、炮制、制剂等)的工艺改进和质量设计,形成高科技水平的中药全程质量控制体系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R28

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