ERFs参与调控黄瓜果实贮藏冷害机制研究

发布时间：2017-08-29 07:45

  本文关键词：ERFs参与调控黄瓜果实贮藏冷害机制研究

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【摘要】：低温贮藏是减轻果蔬采后贮运及物流损失的最有效方式,但很多果蔬特别是热带亚热带果蔬容易发生冷害,冷害成为果蔬采后低温贮运的主要胁迫。黄瓜是典型的冷敏性果实,在贮藏温度低于10℃时极易产生冷害,主要症状表现为果实水渍状凹陷,失水严重,萎蔫变黄,清新气味消失,从而影响果实的商品价值。ERF是一类植物特有的转录因子,在生物及非生物逆境中起着重要的作用,但其与黄瓜果实冷害的关系及其参与调控冷害的机制目前研究较少。为此,本实验中,我们以“津冬”黄瓜果实为材料,采用转录组测序(RNA-Seq)的方法,比较冷害过程中黄瓜果实转录水平基因表达的差异,重点关注ERF转录因子在黄瓜冷害及减轻冷害的进程中的表达模式,获得与冷害相关的ERF基因,分离其全长序列,并采用qRT-PCR方法验证其表达特征,分析了ERF转录因子在黄瓜冷害及减轻冷害的进程中的表达模式,同时采用酵母双杂交的方法筛选与冷害相关ERFs互作的组蛋白去乙酰化酶基因HDACs,并用BiFC的方法进行了体内验证,期望阐明ERF转录因子在黄瓜果实采后冷害过程中的作用及机制。主要研究结果如下:1.15℃冷锻炼处理2d能够减轻贮藏8℃条件下的黄瓜果实冷害,提高了黄瓜果实耐冷性。2.对冷害过程中的黄瓜果实进行了转录组测序(RNA-Seq),获得了337个差异表达基因,其中29个ERF基因表达模式呈现差异,将其命名为CsERF1-29。同时,从NCBI中获得了黄瓜所有的21个HDA基因家族成员,命名为CsHDA1-21以进行后续研究。3.荧光定量分析表明,CsERFs和CsHDAs基因表达水平与黄瓜果实冷害有一定关系。qRT-PCR分析显示,随着低温贮藏时间的延长,CsERF1、14、17、18、24、28、29和CsHDA3、7、8、17、18、21表达水平呈上调趋势,而CsERF4、7、8、16、27则呈下调。表明,这些基因可能与黄瓜果实冷害相关。4.采用RT-PCR与RACE相结合的方法,获得了CsERF4、18、27、29和Cs HDA3、7、8、17、18、21基因的全长cDNA序列。采用酵母双杂(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验证实了冷害相关CsERF29可与组蛋白去乙酰化酶CsHDA18存在互作。这个互作在黄瓜果实冷害中的生物学意义仍需进一步研究。
【关键词】：黄瓜果实 冷害 冷锻炼 ERF转录因子 蛋白互作
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S642.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩略词英文对照表6-11
• 1 前言11-18
• 1.1 果实冷害研究状况11-12
• 1.2 冷锻炼处理减轻果实贮藏冷害12-13
• 1.3 转录组测序的研究进展13-14
• 1.4 ERF转录因子的研究进展14-16
• 1.4.1 ERF转录因子的结构14-16
• 1.4.2 植物冷害与ERF转录因子研究进展16
• 1.5 植物组蛋白去乙酰化酶基因研究进展16-17
• 1.6 植物ERF转录因子和组蛋白去乙酰化酶HDAC关系的研究进展17
• 1.7 本文的研究目的与意义17-18
• 2 材料与方法18-35
• 2.1 供试材料18
• 2.2 冷锻炼处理方法18-19
• 2.3 黄瓜生理指标测定的方法19-20
• 2.3.1 黄瓜果实冷害发生率和冷害发生指数的测定19
• 2.3.2 黄瓜果实失重率的测定19
• 2.3.3 黄瓜果实相对电导率的测定19
• 2.3.4 黄瓜果实TSS的测定19
• 2.3.5 黄瓜果实叶绿素含量的测定19-20
• 2.3.6 黄瓜果实叶绿素荧光的测定20
• 2.4 样品总RNA的提取及检测20-21
• 2.4.1 样品总RNA提取20-21
• 2.4.2 样品总RNA浓度的测定及完整性检测21
• 2.5 黄瓜转录组测序21-24
• 2.5.1 MRNA的分离22-23
• 2.5.2 测序23
• 2.5.3 序列拼接23-24
• 2.5.4 功能注释、分类和代谢途径分析24
• 2.6 CDNA模板制备24-26
• 2.6.1 总RNA的纯化及检测24-25
• 2.6.2 CDNA模板合成25-26
• 2.7 CSERF4、18、27、29和CSHDA3、7、8、17、18、21基因全长CDNA的克隆26-27
• 2.8 CSERFS的氨基酸序列分析27
• 2.8.1 CSERF氨基酸序列的同源性分析27
• 2.8.2 CSERFS的系统进化分析27
• 2.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）27-30
• 2.10 CSERF4、18、27、29的转录激活分析30-32
• 2.10.1 酵母菌株30
• 2.10.2 载体构建30
• 2.10.3 酵母感受态细胞的制备及PEG\LiAc介导的质粒转化30-32
• 2.10.4 a-半乳糖苷酶（a-galactosidase）活性检测32
• 2.11 酵母双杂32-33
• 2.12 双分子荧光互补实验（BiFC）33-35
• 3 结果与分析35-57
• 3.1 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实外观的影响35-36
• 3.2 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实品质的影响36-38
• 3.2.1 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实失重率的影响36-37
• 3.2.2 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实冷害发生率和冷害指数的影响37-38
• 3.3 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实生理变化的影响38-40
• 3.3.1 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实相对电导率的影响38-39
• 3.3.2 冷锻炼处理对冷藏黄瓜果实叶绿素含量和叶绿素荧光的影响39-40
• 3.4 黄瓜果实总RNA的提取40-41
• 3.5 黄瓜果实转录组测序结果分析41-47
• 3.5.1 黄瓜果实转录组差异基因的聚类分析42-43
• 3.5.2 黄瓜果实转录组的GO分类和KEGG分类43-45
• 3.5.3 黄瓜果实转录组差异基因的维恩图分析及表达差异的CSERFS基因的筛选45-47
• 3.6 黄瓜果实冷害过程中CSERFS和CSHDACS基因的表达特性分析47-50
• 3.6.1 CSERF1-29和CSHDA1-21基因荧光引物的筛选47-48
• 3.6.2 CSHSFS和CSHDAS在黄瓜果实冷害过程中的表达分析48-50
• 3.7 CSERFS的序列分析50-53
• 3.7.1CSERFS氨基酸序列的同源性分析50-52
• 3.7.2 CSERF4、18、27、29氨基酸序列的基本特性52
• 3.7.3 CSERF4、18、27、29的进化关系分析52-53
• 3.8 CSERFS在酵母内的转录活性分析53-55
• 3.9 CSERFS与CSHDAS的蛋白互作分析55-57
• 3.9.1 酵母双杂交分析CSERFS与CSHDAS的蛋白互作55-56
• 3.9.2 双分子荧光互补技术（BiFC）验证CSERF29与CSHDA18的蛋白互作56-57
• 4 讨论57-60
• 4.1 冷锻炼处理可以减轻黄瓜果实采后贮藏冷害57-58
• 4.2 通过转录组测序获得黄瓜果实基因表达信息58-59
• 4.3 CSERFS参与调控黄瓜果实采后贮藏冷害及其机制59-60
• 5 结论60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-72

【参考文献】

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本文编号：752149