用于病毒核酸快速提取的新型磁性纳米材料的设计、制备和应用研究

发布时间：2018-03-02 02:33

本文关键词： 磁性纳米粒子表面修饰磁分离病毒核酸提取　出处：《东南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：病毒是一类严格的细胞寄生生物,主要由蛋白质外壳和核酸组成。有些病毒能够感染人或植物,并引起严重的人类传染病或植物病害,从而对人类健康或作物生产产生严重的危害。由于病毒对人类健康和植物生长具有极大威胁。因而,快速、有效和灵敏的检测技术对于有效控制病毒传播的具有十分重要的意义。本论文旨在通过合成不同表面化学修饰的四氧化三铁磁性颗粒,并分析磁性颗粒与核酸(DNA和RNA)之间的吸附与解吸附性质,进而建立基于磁性颗粒的病毒核酸提取方法,结合实时荧光定量PCR技术,实现病毒的灵敏、快速检测。主要内容及工作结果归纳如下：(1)利用高温裂解法和熔剂热法合成粒径大小分别为10和200 nm左右的四氧化三铁磁性颗粒。在此基础上,首先利用四乙氧基硅烷修饰10 nm四氧化三铁磁性纳米颗粒,合成二氧化硅包裹的磁性颗粒(Silica-coated magnetic particles, SMPs),从而改善磁性颗粒在水溶液中的分散性,获得表面带有负电的磁性颗粒；另外,依次利用四乙氧基硅烷和γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰200 nm的四氧化三铁磁性颗粒,合成氨基硅烷化磁性颗粒(Aminosilane-modified magnetic particles, AMPs);最后,利用羧基苯硼酸对10 nm四氧化三铁磁性颗粒进行功能化修饰,获得羧基苯硼酸修饰的磁性纳米颗粒(Carboxyphenylboronic acid-functionalized magnetic particles, CPBA-MNPs)。磁性颗粒的表征结果表明,成功合成了上述不同表面化学修饰的磁性颗粒,其表面基团分别为：羟基、氨基和苯硼酸。(2)以鲑鱼精DNA和大肠杆菌RNA为材料,分析SMPs与核酸的吸附和解吸附性质。结果表明：在低浓度异硫氰酸胍(1.0 M)溶液中,SMPs对核酸的吸附量最大；Langmuir吸附等温线拟合分析表明,1 mg SMPs对DNA和RNA的最大吸附量分别为10.6μg和7.6μg；溶液的酸碱性质对于吸附量具有较大的影响,在酸性条件下,能够显著降低核酸与SMPs间的静电斥力,从而提高核酸吸附量；乙醇与异丙醇的加入能够降低吸附体系的极性,从而增加核酸的吸附量。CPBA-MNPs与核酸之间的吸附与解吸附性质分析结果表明：二价阳离子(如Ca2+、Mg2+)以及乙醇的加入能够显著提高核酸吸附量；在酸性条件下,RNA的吸附量大于在碱性条件下的吸附量；由于苯硼酸分子与RNA之间形成了可逆的环酯结构,通过加入顺式双醇类似物可有效地将RNA洗脱,Tris-EDTA溶液(50 mM Tris,5 mM EDTA, pH 8.8)的洗脱效率分别为75.6±7.6%(DNA)和60.1±5.9%(RNA)(3)在研究SMPs与核酸吸附与解吸附性质的基础上,以SMPs为吸附材料,分析提取血清中乙肝病毒和丙肝病毒核酸的可行性,以及利用实时荧光PCR/RT-PCR实现对乙肝病毒和丙肝病毒的快速检测。结果表明：在蛋白酶K和1.0 M异硫氰酸胍存在的条件下,56℃水浴15 min能够有效的释放HBV和HCV的核酸；通过加入1倍体积乙醇,能够有效的分离提取HBV和HCV的核酸；建立HBV和HCV的实时荧光PCR/RT-PCR检测方法和定量标准曲线能够有效的应用于HBV和HCV的检测与定量。利用实时荧光PCR/RT-PCR技术定量分析SMPs的核酸回收效率分别为30±11.1%(HBV)和34±7.3%(HCV),高于已报道的商业试剂盒的提取效率。此外,将上述方法应用于进出北京口岸旅行人员的乙肝与丙肝病毒的检测与分析,结果表明,SMPs方法和实时荧光PCR/RT-PCR方法能够有效地用于出入境人员的病毒核酸提取和分析工作中。(4)以SMPs为固相吸附载体,建立提取植物病毒核酸的方法,并应用于植物病毒(南芥菜花叶病毒、百合无症病毒)及类病毒(啤酒花矮化类病毒、葡萄黄斑类病毒1)的检测。利用体外转录合成覆盖实时荧光RT-PCR扩增区的RNA标准品,构建标准曲线。结果表明,标准曲线覆盖6-7个数量级,并且最低检测限为100拷贝／反应。为评价SMPs方法的核酸提取效率,将体外转录合成的RNA标准品加入到植物样品裂解液中,分别利用SMPs方法、TRIzo1和RNeasy Plant mini kit回收提取。结果表明,在回收百合叶片样品中的核酸时,SMPs方法与两种商业试剂盒相等,无明显差异；而当回收葡萄叶片中的核酸时,SMPs方法的回收效率高商业试剂盒2-3倍。利用SMPs方法分别提取15株感染LSV和15株感染ArMV的百合样品,利用实时荧光RT-PCR进行检测。对于检测ArMV, SMPs方法与其他方法没有明显统计学上的差异,而对于检测LSV,结果略有不同。同TRIzo1相比,SMPs方法具有相同的病毒载量数量级,而与RNeasy Plant mini kit相比,SMPs方法的平均病毒载量低0.51oglo。利用SMPs方法提取19株葡萄样本的核酸,采用实时荧光RT-PCR方法进行HSVd和GYSVd-1筛查。结果显示,无论是HSVd还是GYSVd-1,在阳性率和病毒载量上,SMPs方法均优于其他方法(TRIzol和RNeasy Plant mini kit)。因此,SMPs方法能够有效的提取植物病毒与类病毒核酸,从而实现植物病毒和类病毒的快速检测。(5)基于CPBA-MNPs与DNA和RNA的吸附与解吸附性质,建立针对复杂植物样本材料的核酸提取方法。CPBA-MNPs提取核酸的可行性分析结果表明,Tris与EDTA对CPBA-MNPs吸附核酸具有不利影响；在不同的条件下,可分别提取玉米与大豆种子样品中的基因组DNA,总核酸或RNA,并且具有较高的质量。此外,将提取大豆种子(感染菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒)的RNA和转基因玉米的基因组DNA进行实时荧光RT-PCR/PCR进行检测,结果表明利用苯硼酸修饰的磁性纳米颗粒提取的核酸适用于实时荧光RT-PCR/PCR检测。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;TB383.1

【相似文献】