基于新型MyD88信号通路抑制剂探索GVHD靶向防治新策略及其机理

发布时间：2018-03-28 10:45

  本文选题：移植物抗宿主病　切入点：TLR4　出处：《华中科技大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分MyD88信号过表达与急性G疾病进展的相关性 [目的]探讨TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)中的表达及意义。 [方法]以雄性C57BL/6(H-2Kb)小鼠和雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠作为骨髓移植的供受者,术前受者接受致死剂量(8.0Gy)的全身照射处理,4～6小时内输注供者来源的骨髓细胞(1*107)和不同数量的脾脏淋巴细胞(1*107,n=12或2*107,n=12)建立不同严重程度的小鼠急性GVHD模型,未接受任何处理的正常BALB/c小鼠作为空白对照(n=6)。以GVHD临床评分,生存期,靶器官病理作为GVHD的评价指标；分别采用实时荧光定量PCR,免疫组化和western blot法检测GVHD模型小鼠小肠组织中TLR4、MyD88和NF-κBp65的表达;并统计其基因表达谱的改变与GVHD进展的相关性。 [结果]急性GVHD的病情进展依赖于异基因脾脏淋巴细胞的输注数量,随GVHD的病情恶化,小肠组织中TLR4、MyD88与NF-κBp65的表达均呈上升趋势。重度GVHD小鼠病变肠组织TLR4, NF-κBp65mRNA水平较正常对照显著升高(P0.05)。组织中蛋白表达也有相同的趋势。此外,TLR4、MyD88和NF-κB mRNA间的表达不仅呈正相关,而且其与GVHD的临床评分也呈正相关(R=0.814,P0.001；R=0.828,P0.001；R=0.568,P--0.034)。 [结论]GVHD小鼠靶器官组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路呈明显的活化状态,基因转录和蛋白翻译均有增强,且与GVHD病情呈显著的正相关,可作为药物研发的新靶点。 第二部分新型MyD88抑制剂TJ-5缓解急性GVHD及机制 [目的]探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5(TJ-5)对在小鼠异基因骨髓移植后急性GVHD的抑制作用及机制,基于天然免疫为GVHD的药物治疗提供新思路。 [方法](1)免疫共沉淀检测TJ-5对MyD88同源二聚化的影响：流式细胞术及ELISA检测TJ-5对DC成熟活化的影响;蛋白质印迹检测TJ-5对DC内MyD88信号通路关键分子的表达影响；淋巴细胞混合培养检测TJ-5对异基因T淋巴细胞增殖的作用。(2)建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c (H-2K)的小鼠骨髓移植后急性GVHD模型。实验分为四组：GVHD空白对照组,TJ-5治疗组,CD40L单抗(MR1)治疗组,联合治疗组。术后以GVHD临床评分,生存期,靶器官病理,炎性因子水平,组织坏死与修复,嵌合体形成及特异性耐受的形成作为药物疗效的评价指标,比较两药单独用药的差异及联合用药治疗GVHD的效果。 [结果]TJ-5能够剂量依赖性的抑制MyD88分子的同源二聚化和LPS刺激引起的DC成熟,减少其上清液中炎性因子IL-la, IL-10,IL-12和IL-18分泌：随TJ-5剂量增加,DC表面TLR4的表达逐渐升高,而下游分子IRAK4,NF-Bp65的表达却明显降低；TJ-5能减少DC/T混培体系中CD4+T和CD8+T淋巴细胞的增殖。移植后观察60天,TJ-5与MR1组生存期,GVHD临床评分均显著优于对照组(P0.05)；联合用药效果更佳,60天生存率达100%,明显高于MR1组(70%),TJ-5组(57%)和对照组(0%);对照组小鼠肝脏,小肠,皮肤组织Thomas GVHD病理分级Ⅲ-Ⅳ级,其余三组靶器官病变较轻,呈Ⅰ～Ⅱ级改变。TJ-5治疗可加速异基因嵌合体的形成,明显改善GVHD小鼠血循环中炎性因子,减少靶器官细胞凋亡,并促进组织修复。 [结论]新型MyD88抑制剂TJ-5可缓解小鼠骨髓移植后GVHD的进展,天然免疫与获得性免疫系统同时抑制策略可取得更好的抗GVHD效果,具有广阔的应用前景。 第三部分TJ-5对荷骨髓瘤小鼠骨髓移植后GVT的影响 [目的]探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5(TJ-5)在抗GVHD的同时能否保留GVT效应,为TJ-5的临床应用提供进一步实验依据。 [方法]建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c(H-2Kd)的GVHD荷骨髓瘤(SP2/0)小鼠模型。实验分为三组：骨髓重建对照组,肿瘤复发组,单纯T细胞组,T细胞与TJ-5共同作用组。小鼠的死亡归结为GVHD相关死亡和肿瘤复发相关死亡进行评价。观察60天,记录各组GVHD体重变化,绘制临床评分和生存曲线。对GVT靶器官脾脏和骨髓进行病理检测：流式细胞术检测TJ-5对骨髓瘤细胞系SP2/0凋亡坏死和细胞周期的影响,对DC表面趋化因子CCR7表达的影响和对受者脾脏内Treg的比例的影响,以进一步明确保留GVT效应的可能机制。 [结果]TJ-5治疗组与GVT对照组60天存活率分别为50%与12.6%,荷瘤死亡率组间有显著统计学差异(P=0.04),TJ-5组GVT靶器官骨髓,脾脏组织病变减轻,肿瘤细胞浸润减少,与单纯GVT对照组相比,并未观察到削弱的GVT改变。在体外实验条件下,TJ-5可剂量依赖的促进骨髓瘤SP2/0细胞的的凋亡与坏死,并使SP2/0细胞的增殖生长周期停滞在G1期;TJ-5可抑制LPS导致的DC表面趋化分子CCR7的表达上调;经TJ-5治疗后的GVHD小鼠脾脏内Treg的含量明显增高,差异据有统计学意义(P0.05)。 [结论]TJ-5治疗荷瘤GVHD小鼠过程中对移植物GVT效果并无明显的抑制作用。TJ-5保留GVT效应的机制可能与直接诱导肿瘤细胞死亡,趋化因子CCR7表达下调,受体Treg含量增加有关。 第四部分单纯宿主MyD88基因缺陷无GVHD保护作用 [目的]探讨宿主来源MyD88分子在异基因骨髓移植后急性GVHD进展中的作用,为TJ-5临床应用时间窗提供实验依据。 [方法]以野生型(wt)或MyD88基因敲除(ko)BALB/c(H-2Kd)小鼠作为受体,C57BL/6(H-2Kb)小鼠为供体,建立小鼠急性GVHD模型。观察30天,以生存期,体重变化,GVHD I临床评分,病理,炎性因子水平作为GVHD评价指标。激光共聚焦技术评价供者源性细胞在宿主体内的增殖情况,确定细胞类型与效应；ELISA检测受体内LPS的水平差异；免疫组化检测肠上皮细胞的增殖与凋亡；蛋白印迹法检测肠上皮细胞内MyD88依赖性Cox-2信号的表达；实时定量PCR检测肠上皮紧密连接蛋白(ZO-1, claudin-3和occludin)的表达评价肠屏障功能；淋巴细胞混合培养技术检测受体MyD88敲除对异基因淋巴细胞增殖的影响。 [结果]在相同的预处理实验条件下,MyD88-/-小鼠较wt宿主表现出更严重的GVHD:生存时间,体重下降,GVHDI临床评分均具有统计学差异(P0.05); MyD88敲除加重肝脏和小肠病理损伤,增加外周循环中LPS的含量和组织中GVHD相关炎性分子(TNF-α、IL-4和IL-12)的表达。相对于野生型受体而言,MyD88-/-小鼠脾脏,小肠和肝脏内有更多的H-2kb阳性的供者细胞和DC浸润,肠上皮细胞凋亡增加,增殖减少。MyD88依赖的Cox-2的表达在MyD88-/-小鼠肠上皮细胞中显著下降(P0.05);肠上皮紧密连接分子ZO-1, claudin-3和occludin在MyD88-/-GVHD小鼠肠道和肝脏中的表达均明显下降,组间差异具有统计学意义(P0.05); MyD88基因缺陷未明显降低混培体系中的异基因淋巴细胞增殖。 [结论]宿主MyD88分子在GVHD进展中起到一定的保护作用,机制与减少供者效应细胞的浸润,增加肠上皮屏障的稳定性与黏膜保护性分子Cox-2的表达有关。骨髓移植前给予TJ-5抑制MyD88分子并不能缓解GVHD的进展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7

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本文编号：1675995