骨髓移植新策略—磁力诱导细胞靶向移植模型的建立与研究

发布时间：2018-08-02 11:55

【摘要】：研究背景造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)是指通过大剂量化学治疗(简称化疗)和／或放射治疗(简称放疗)预处理,清除受者体内的肿瘤／异常细胞和造血／免疫细胞,再将自体或异体骨髓细胞移植给受者,使受者重建造血及免疫系统。HSCT主要分为自体移植和异体移植(包括异基因和同基因),根据来源又可分为骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)、外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT)和脐血移植(cord blood transplantation, CBT),广泛用于治疗恶性血液病、非恶性血液病、遗传性疾病、某些实体瘤和自身免疫性疾病。HSCT后造血系统和免疫系统快速有效的重建意义重大,可直接影响移植效果、生存率和患者的生存质量。目前可能促进HSCT后造血和免疫重建的策略有：(1)增加移植的细胞量：HSCT后造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的归巢和植入直接影响了移植后造血系统和免疫系统的重建,增加移植的细胞量,可以提高归巢和植入的HSCs的总数量。但根据文献报道,骨髓中HSCs比例极低,仅约1%,故增加移植细胞量的同时也输入了大量异体细胞,增大了出现移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的机率,增加移植并发症的发生,严重时甚至可危及患者的生命；(2)移植纯化的HSCs:移植纯化的HSCs可增加HSCT细胞中HSCs的比例,提高HSCs的归巢率和植入率。但HSCs的分离纯化成本高,难度系数大。而且相关研究也表明,HSCT后不仅HSCs在造血和免疫恢复中起作用,一些间质细胞也起着重要的作用,过度纯化反而可能会影响移植的效果；(3)使用体外扩增的HSCs进行移植：体外扩增可获得大量相对较纯的HSCs,用其进行移植可显著提高HSCs的归巢率和植入率。但相关研究表明HSCs在体外扩增的过程中,其表面抗原和部分特性可能发生改变,移植入体内后造血重建效果不佳；(4)骨髓腔内注射移植(intra-bone marrow injection, IBM-BMT):自2001年Kushida等报道骨髓腔内注射HSCs移植可提高移植后HSCs的归巢率以来,后续大量研究者们也反复进行了相关研究和尝试,证实相较于静脉移植,骨髓腔内注射移植可明显提高移植后HSCs的归巢率和机体的生存率,同时可相对减少移植所需的细胞量,进而减少GVHD的发生：(5)提高HSCs归巢至骨髓的比例：此策略颇具前景,亦为本课题提出靶向移植思路的来源。机体在常规接受静脉输注移植后,HSCs随着血液循环至全身组织并大量被阻滞在肺脏、肝脏、脾等器官内,仅有少量HSCs归巢至骨髓,植入并分裂分化,逐渐完成造血和免疫重建。如何让HSCs大量定向归巢至骨髓,且在骨髓局部长时间停留,提高植入率?本课题探索以磁力诱导细胞靶向移植(Magnetism-induced cell target transplantation, Magic-TT)来达到这个目的。Magic-TT是指将移植的造血细胞磁化标记,HSCT后在靶器官(骨髓)局部短期施加一个适宜强度的磁场,磁化的细胞在磁力的作用下,迅速进入靶器官(骨髓),在局部停留并定植,此时再撤去磁场,细胞可继续增殖、分化或迁移至其它部位。Magic-TT的优势如下：(1)可能提高移植细胞的归巢率,缩短造血和免疫重建时间,提高生存率；(2)联合骨髓腔内(Intra-bone marrow, IBM)注射移植,可能进一步提高移植后细胞的归巢率,从而减少移植的细胞量,减少GVHD的发生率,提高生存质量。研究目的1.建立eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植模型,观察移植后骨髓腔内HSCs的空间分布和定位。2.建立eGFP和mRFP双荧光蛋白转基因小鼠异基因骨髓移植模型,观察移植后骨髓腔内HSCs的空间分布和定位。3.在eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植模型中,探索Magic-TT是否可提高移植后细胞的归巢率,缩短造血和免疫重建时间。研究内容第一部分eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植后骨髓腔内HSCs的空间分布和定位[方法](1)20只C57BL/6受者雌性普通小鼠,随机分为实验组和对照组,各10只,移植前肠道准备；(2)5只C57BL/6雄性eGFP荧光蛋白转基因供者小鼠,脱臼后取双侧股骨,制备成骨髓悬浮液；(3)两组小鼠经7Gy强度清髓性放疗后,实验组尾静脉输注O.1ml骨髓液,细胞数约(5×106)／只,对照组尾静脉输注0.1mlPBS；(4)移植后观察两组小鼠的一般情况、植入水平、造血恢复和生存期等。在受鼠造血恢复的过程中,取股骨半固体脱钙后,用共聚焦显微镜等观察骨髓中供者绿荧光细胞的分布、形态和定位等。[结果](1)实验组小鼠的造血恢复为(19.87±1.81)天,外周血中RFP+比例为(92.67±6.65)%；(2)对照组移植后第5天开始有小鼠死亡,第11天全部死亡,中位生存期为7.5d,死亡原因为造血衰竭,死亡时外周血白细胞均0.5×109/L,病死率达100%；(3)受鼠股骨经半固体脱钙后,直接在共聚焦显微镜下可清晰的观察到骨髓腔中供者绿荧光细胞的形态和空间分布。[小结]本部分实验使用eGFP荧光蛋白转基因小鼠成功构建了eGFP-普通小鼠的同基因骨髓移植模型。供者细胞自带绿荧光,该模型有助于探索移植后供者细胞在受者体内的迁移和分布,同时结合本团队自创的半固体脱钙法,在缓慢脱钙的过程中半固体成分轻微流动,作为支撑成分逐步替代股骨中的钙质成分,原位保留了股骨中供者细胞的位置、形态和荧光,在共聚焦显微镜下可清晰地观察到移植后受鼠骨髓中供者细胞的分布、形态和地位,为探索移植后受鼠骨髓中供者细胞的分布、归巢和寻找造血干细胞“龛”的位置提供了新的思路,具有应用价值。第二部分eGFP和mRFP双荧光蛋白转基因小鼠异基因骨髓移植后骨髓腔内HSCs的空间分布和定位[方法](1)20只C57BL/6雌性eGFP转基因小鼠,随机分为实验组和对照组,各10只,移植前肠道准备；(2)5只FVB雄性：nRFP荧光蛋白转基因供者小鼠,脱臼后取双侧股骨,制备成骨髓悬浮液；(3)两组小鼠经7.5Gy强度清髓性放疗后,实验组尾静脉输注0.2m1骨髓液,细胞数约(5.0×106)/只,对照组尾静脉输注0.2ml PBS;(4)移植后观察两组受鼠的一般情况、植入水平、造血恢复、移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和生存期。在受鼠造血恢复的过程中,取股骨半固体脱钙,用共聚焦显微镜等观察骨髓中红绿细胞的分布、形态和相互作用关系。[结果](1)实验组小鼠的造血恢复为(20.00±3.07)天,外周血中RFP+比例为(93.94±1.59)%；1个月内4/10只受鼠有aGVHD表现；(2)对照组移植后第5天开始有小鼠死亡,第11天全部死亡,中位生存期为8.5d,死亡原因为造血衰竭,死亡时外周血白细胞均0.5×109/L,病死率达100%。(3)受鼠股骨经半固体脱钙后,共聚焦显微镜下可见骨髓腔中mRFP+细胞主要位于骨小梁周围且被大量的GFP+细胞所包绕,三维构建后可清楚地观察到骨髓微环境中红绿荧光细胞的相互作用。[小结]本部分实验使用eGFP和mRFP荧光蛋白转基因小鼠成功构建了mRFP→eGFP的双荧光小鼠异基因骨髓移植模型,结合半固体脱钙法可清晰的观察到移植后骨髓中供者细胞的分布及供受者细胞间的相互关系,为临床观察移植后供者细胞的分布、归巢等相关研究提供了基础。第三部分Magic-TT在eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植中的研究[方法](1)40只C57BL/6受者雌性普通小鼠,随机分为4组,分别为A组：尾静脉+磁珠组、B组：尾静脉+磁珠+小磁场组、C组：尾静脉+磁珠+中磁场组、D组：尾静脉+磁珠+大磁场组,各10只,移植前肠道准备；(2)5只C57BL/6雄性eGFP荧光蛋白转基因供者小鼠,脱臼后取双侧股骨,制备成骨髓悬浮液；(3)骨髓悬浮液中先后加入Anti-Sca-1-FITC、Anti-FITC磁珠孵化,使骨髓细胞中HSCs尽可能多的被纳米磁珠标记；(4)4组小鼠经7Gy强度清髓性放疗后,均分别尾静脉输注0.1ml含纳米磁珠的骨髓液,细胞数约(5×106)／只；(5)4组小鼠在移植后分别在股骨处不加磁场、加上弱磁场、中磁场和强磁场,24h后去除磁场；(6)观察4组小鼠的一般情况,监测体重、血常规、嵌合率、生存期等。[结果]小鼠于照射后体重进行性下降,伴活动减少,1周后精神、活动逐渐恢复,磁场组的部分小鼠磁铁脱落,部分小鼠因磁铁夹闭过紧而导致下肢红肿甚至骨折。(1)4组小鼠的生存情况分别为：A组对照组移植后d17死亡2只,余生存时间30d,存活率80%；B组弱磁场组小鼠全部存活,生存时间30d,存活率100%；C组中磁场组移植后d15死亡1只,余生存时间30d,存活率90%；D组强磁场组移植后d11死亡1只,余生存时间30d,存活率90%。4组小鼠移植后的生存时间差异无统计学意义。(2)4组小鼠造血基本恢复时,外周血中RFP+比例分别为(91.35±9.81)%、(95.13±1.50)%、(94.23±0.86)%、(91.53±3.30)%,表明移植成功。(3)将4组小鼠移植后的血常规进行比较：白细胞P=0.0810.05,无统计学差异；血红蛋白P=0.3280.05,无统计学差异；血小板P=0.0070.05,有明显统计学差异,进行组间的多重比较,A组与B组P=0.1430.05、A组与C组P为=0.6240.05,均无统计学意义,A组与D组P=0.0260.05,有明显统计学差异,且D组平均血小板数高于A组,B组与C组P=0.0100.05,有明显统计学差异,且B组平均血小板数高于C组,D组与C组P=0.0000.05,有明显统计学差异,且D组平均血小板数高于C组,B组与D组P=0.1550.05,无明显统计学差异。[小结]本部分实验在第一章eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植的基础上,将供者小鼠的骨髓细胞磁化+受者小鼠的股骨部位加入不同梯度的磁场,探索在磁场的作用下对小鼠移植后造血恢复的影响。结果初步表明在本次实验所使用的磁场强度范围内,Magic-TT在eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植中,对白细胞和血红蛋白的恢复无明显影响,但随着磁场强度的增大,当达到一定磁场强度后可以缩短移植后血小板的造血恢复时间,这对改善移植后机体的造血恢复有重要意义。结论和展望通过以上三部分的实验研究,分别成功建立了eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植模型、红绿双荧光蛋白转基因小鼠异基因骨髓移植模型。在以上两种模型的基础上,结合自创的半固体脱钙体系,清晰地观察到移植后骨髓腔内红绿荧光细胞的位置、形态及供受者细胞间的相互作用关系。本实验采用了荧光蛋白转基因小鼠进行移植,供受者小鼠细胞自带红绿荧光便于观察,该模型的建立对探索移植后供者细胞在受者小鼠体内的分布、迁移、滞留等相关研究提供了极大便利,具有重要意义。同时结合自创的半固体脱钙体系,使直接观察移植后小鼠骨髓腔内供受者细胞的位置、形态及相互作用关系更加清楚,为追踪移植后HSCs的归巢和探索移植后小鼠造血恢复过程中供受者细胞在骨髓微环境中的相互作用提供了更广阔的思路,具有重大意义。本实验的第三部分探索了Magic-TT在eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因骨髓移植中,对移植后小鼠造血恢复的影响,初步证实了Magic-TT在本次实验所使用的磁场强度范围内对白细胞和血红蛋白的恢复无明显影响,但随着磁场强度的增大,当达到一定磁场强度后可以缩短移植后血小板的造血恢复时间,其深入研究和进一步完善将会为临床改善移植后患者血小板的恢复情况提供良好的方法,具有重要的临床应用价值。后期本课题的延续将考虑使用Magic-TT联合骨髓腔内移植(Intra-bone marrow, IBM),我们预测两者的联合可能进一步提高移植后HSCs的归巢率,减少移植的细胞量,缩短移植后的造血恢复时间,同时减少GVHD的发生,从而提高总体生存率,改善生存质量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7

【共引文献】