粘着斑激酶信号通路对脊髓背角痛觉突触传递的调节作用

发布时间：2019-12-03 02:29

【摘要】：目的：粘着斑激酶(focal adhesion kinase; FAK)是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶(non-receptor protein tyrosine kinase),对动态调节细胞粘附结构至关重要。最近有研究显示,FAK也存在于兴奋性谷氨酸能突触、并参与突触可塑性的调节。然而,FAK在脊髓中枢敏感化过程中的作用仍然不清楚。细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2; ERK1/2)和N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate; NMDA)型谷氨酸受体的活性与痛觉敏化密切相关。本研究的目的,在于探讨FAK对脊髓背角ERK1/2的活性及NMDA受体介导的痛觉突触传递的调控作用。方法：本研究通过小鼠后足底皮下注射完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant;CFA)来创建疼痛模型,再通过免疫蛋白印迹、行为学测试、膜片钳电生理学记录、免疫组织化学等方法来探讨外周炎性损伤对脊髓背角FAK信号通路的调节作用及其意义。结果：(1)免疫组织化学的结果显示：FAK表达于痛觉调控的关键部位---脊髓背角神经元中；(2)足底注射CFA后,脊髓背角FAK的第397位酪氨酸残基(FAK-Tyr397)的磷酸化水平会显著增加,提示：慢性炎性疼痛的形成伴随有脊髓FAK的活化；(3)鞘内给予NMDA受体拮抗剂D-APV (5μg)、或Ⅰ型代谢型谷氨酸受体(Group I Metabotropic glutamate receptor; Group I mGluR)拮抗剂AIDA (25μg),均能有效降低炎性疼痛小鼠FAK-Tyr397的磷酸化水平,提示：外周组织损伤可能通过激动脊髓NMDA受体和Ⅰ型mGluR受体,诱导FAK的活化；(4)为直接观察FAK在中枢敏感化中的作用,本研究在脊髓背角过表达野生型FAK[FAK(WT)],发现：即使在正常小鼠,FAK(WT)也可诱发明显的热痛觉过敏和机械性痛觉超敏,而过表达无活性的FAK突变体--FAK(Y397F),则对正常小鼠的痛行为不会产生任何影响；(5)免疫印迹实验结果显示：FAK(WT)的一个重要作用,在于激活脊髓背角ERK1/2、显著提高ERK1/2的磷酸化水平；鞘内注射MEK抑制剂U-0126 (0.2μg、0.5μg和1.0 μg),能够剂量依赖性地缓解FAK(WT)诱发的疼痛症状,提示：FAK可能通过ERK1/2信号通路,参与中枢敏感化的形成；(6) FAK(WT)激活的ERK1/2,能够提高NMDA受体GluN2B、GluN1亚基在突触小体膜结构(synaptosomal membrane fraction; P3)中的表达,而对P3中NMDA受体G1uN2A亚基、以及α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑型谷氨酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid; AMPA)受体GluAl亚基的表达却没有明显影响；(7)CFA显著提高脊髓背角ERK1/2的磷酸化水平,而这一作用可被FAK(Y397F)所逆转；(8)电生理学记录显示：将抗FAK的特异性抗体通过记录电极导入炎性疼痛小鼠脊髓背角Ⅱ板层神经元后,NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(Excitatory postsynaptic currents; EPSCs)幅值会显著降低,而非特异性的IgG却无此作用；(9)行为学结果显示：脊髓背角表达FAK(Y397F)、抑制内源性FAK的活性,能够有效缓解CFA诱发的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。结论：FAK可能通过FAK/ERK/GluN2B信号通路诱发NMDA受体的功能亢进,参与脊髓中枢敏感化的形成；直接表达无活性的FAK(Y397F)突变体能够有效缓解慢性炎性疼痛症状。
【图文】：

人体,结构示意图,激酶结构域,粘着斑

图１－１人体ＦＡＫ结构示意图逡逑ＦＡＫ邋的结构。３］包含了一个邋Ｎ－末端的邋ＦＥ民Ｍ邋（Ｆｏｕｒ－ｐｏｉｎｔ－０打ｅ，Ｅｚｒｉｎ，民ａｄｋｉｎ，逡逑Ｍｏｅｓｉｎ）结构域、一个激酶结构域（ｋｉｎａｓｅ邋ｄｏｍａｉｎ）、两个脯氨酸富集域（ｐｒｏ邋ｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ逡逑ｄｏｍａｉｎ）、及一个Ｃ－末端的粘着斑鞭向定位结构域（Ｆｏｃａｌ邋Ａｄｈｅｓｉｏｎ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ逡逑

结构域,蛋白,信号转导通路,脯氨酸

呒っ感藕攀怕范约顾璞辰鞘┚跬淮ゴ鄏莸牡鹘谧饔茫]3?ｄｏｍａｉｎ；邋ＦＡＴ）（图１－１）邋Ｍ。ＦＥＲＭ结构域负责与生长因子受体（ｇ的ｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ逡逑ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、整合素（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）等相互作用，将这些膜蛋白感受的细胞外信号逡逑向细胞内转导。然而，在静息情况下，ＦＥＲＭ结构域会与激酶结构域发生分子内逡逑的结合，这种分子折叠导致ＦＡＫ处于无活性状态—旦膜表面的生长因子受逡逑体、整合素Ｗ及Ｇ蛋白偶联受体（Ｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、受体型酪氨酸逡逑激酶（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｋｉｎａｓｅｓ）等被激抽逦细胞内的钩离子浓逡逑度就会大量增加，同时蛋白激酶Ｃ邋（Ｐｒｏｔｅｉｎ拉ｎａｓｅＱＰＫＣ）也会被激活ｆＷ。在逡逑巧离子和／或ＰＫＣ的作用下，ＦＡＫ就会向细胞膜定位，使得ＦＥＲＭ结构域与跨膜逡逑蛋白、信号蛋白等相互结合；这种结合，，打断了邋ＦＥＲＭ结构域对激酶结构域的逡逑封闭，导致激酶结构域的暴露，随后，ＦＡＫ的第３９７位酪氨酸残基（Ｔｙｒ３９７）就逡逑会发生自身z1酸化
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R402

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