HPLC法测定人体血浆中异环磷酰胺及环磷酰胺的浓度

　　异环磷酰胺和环磷酰胺为同分异构体，为常用的化疗药物，抗癌谱相似，广泛用于治疗常见恶性肿瘤。异环磷酰胺和环磷酰胺血药浓度的测定方法主要是高效液相色谱法，方法样品的预处理存在操作繁琐、不稳定、成本高等问题。本研究在氯仿萃取方法基础上进行改进，建立HPLC法测定异环磷酰胺和环磷酰胺血药浓度，以便更好地满足临床人体血药浓度检测及药代动力学研究的要求。

　　1 材 料

　　1．1 仪器：LC一10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，包括LC-10AT vP高压泵，SPD-10A VP紫外检测器，LC一10ATVP柱温箱，威玛通用色谱数据工作站。

　　1．2 试药：环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司，含量>

　　99．5%，批号20070602)；异环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司，含量>99．5%，批号20070801)；乙晴为色谱纯；氯仿、无水硫酸钠均为分析纯，实验用水为双重蒸馏水。

　　2 方法与结果

　　2．1 对照品和内标溶液的配制：分别精密称取异环磷酰胺、环磷酰胺对照品5O．00mg，分别置于50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至亥 度，得浓度均为1 000 mg·L 环磷酰胺和异环磷酰胺对照品储备液，于冰箱4℃ 保存。用流动相分别稀释异环磷酰胺和环磷酰胺储备液至250 mg·L 作内标工作液；用流动相分别稀释异环磷酰胺和环磷酰胺储备液至500．0，250．0，100．0，5O．0，25．0，10．0，5．0 mg·L 作异环磷酰胺和环磷酰胺工作液；另用流动相分别稀释异环磷酰胺和环磷酰胺储备液至250，125，12．5 mg·L 作质控溶液；于冰箱4℃ 保存。

　　2．2 色谱条件：色谱柱：Zorbax-ODS Cl8(4．6 mm× 250mm，5m)，柱温：室温。流动相：乙晴水(25：75)，流速1．0 mL·min一，检测波长；200 nm，进样量为2O L。在此条件下异环磷酰胺、环磷酰胺的出峰时间约为11．16 min与12．31 min。

　　2．3 样品预处理：取5 mL试管，加入1．5 g的无水硫酸钠，精确吸取250 L血浆样品于试管中，精确加入内标液(250 mg·L 环磷酰胺或250 mg·L 异环磷酰胺20 L)，放置2 min，待无水硫酸钠将血浆吸附完全后，用2．0，1．0 mL氯仿提取，合并提取液，水浴5O ℃ 通氮吹干，用100 L流动相溶解，离心5 min(15 000 r·min )，取上清液2OL进样。

　　2．4 方法专属性考察：取250 L空白血浆分别加入2O L浓度为250 mg·L 环磷酰胺和异环磷酰胺工作液，依2．3方法操作，取上清液2O L进样测定，异环磷酰胺的保留时间为11．16 min，环磷酰胺保留时间为12．31 min。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰目标物的测定，结果见图1。

　　2．5 线性范围和检出限：取健康人空白血浆，加入异环磷酰胺或环磷酰胺工作液，配制异环磷酰胺、环磷酰胺浓度分别为1．0，5．0，10．0，25．0，50．0，100．0，200．0 mg·L 血浆样品，按2．3方法操作。以异环磷酰胺或环磷酰胺与内标的峰面积比(Y)对异环磷酰胺或环磷酰胺的浓度(X)进行线性回归。异环磷酰胺回归方程为y一0．018X+0．015(r一0．999 8，一7)，血浆中异环磷酰胺浓度在1．0～200 mg·L。范围内呈良好的线性关系；环磷酰胺回归方程为Y-二0．020X+0．014(r一0．999 9， 一7)，血浆中环磷酰胺浓度在1．0～200mg·L 范围内呈良好的线性关系。在此色谱条件下，以信噪比(S／N)为3，此方法血浆中异环磷酰胺、环磷酰胺的最低检出限分别为0．2o mg·L 和0．25 mg·L～。A：空白血浆；B：空白血浆+ 异环磷酰胺(20 mg·L )+环磷酰胺(20 mg·L )；C：病人A环磷酰胺血药浓度；D：病人B异环磷酰胺血药浓度；1：异环磷酰胺；2：环磷酰胺

　　2．6 提取回收率：取健康人空白血浆，分别加入异环磷酰胺、环磷酰胺工作液，配制异环磷酰胺、环磷酰胺浓度分别为5．0，50．0，100．0 mg·L。血浆样品，每个浓度5份，按2．3方法操作，记录峰面积；另取12．5，125．0，250．0 mg·L。低、中、高3个浓度异环磷酰胺、环磷酰胺质控溶液直接进样分析，记录峰面积，将血样中峰面积与相应质控溶液峰面积相比，计算提取回收率。

　　2．7 精密度和相对回收率：取健康人空白血浆，分别加入异环磷酰胺、环磷酰胺工作液，配制异环磷酰胺、环磷酰胺浓度分别为5．0，50．0，100．0 mg·L 血浆样品，每个浓度5份，按2．3方法操作，用标准曲线计算血样中异环磷酰胺、环磷酰胺的浓度，计算相对回收率，同日内每种浓度的样品平行操作5次和每天1次连续考察5 d，分别计算方法的日内、日间精密度。

　　2．8 稳定性考察

　　2．8．1 储备液的稳定性考察：取异环磷酰胺及环磷酰胺质控溶液在1，7，1 5，30，45，60 d直接进样2OL，记录峰面积。

　　结果：异环磷酰胺、环磷酰胺的峰面积的RSD分别为1．5%，1．3%，表明异环磷酰胺、环磷酰胺至少在60 d内稳定。

　　2．8．2 血浆样品存放期间的稳定性考察：取健康人空白血浆数份，加入异环磷酰胺、环磷酰胺工作液，配成浓度为50．0mg·L 血浆样品，放置20℃冰箱中，反复冻融6次，处理后进样，考察其冻融稳定性，结果：异环磷酰胺、环磷酰胺峰面积RSD分别为3．0%、2．8%。另外在第0，5，10，20，30天时取样分析，考察存放期间的稳定性，结果，异环磷酰胺、环磷酰胺峰面积RSD分别为2．7%、2．5%。表明含异环磷酰胺、环磷酰胺血浆在一2O℃ 冰箱中30 d是稳定的。

　　2．9 方法应用：病人A，女，4O岁。人院诊断为食道淋巴瘤，收住于本院化疗科，按医嘱于2008年8月10日静脉推注环磷酰胺1 g，用药6 h后，抽取病人前臂静脉血样，测定环磷酰胺血药浓度为8．01 mg·l。病人B，男，16岁。入院诊断为左胫骨上段骨肉瘤，收住于本院化疗科。按医嘱于2008年8月10日用异环磷酰胺5 g化疗，静脉滴注3 h，结束后6 h抽取病人前臂静脉血样，笔耕论文新浪博客，测定异环磷酰胺血药浓度为44．48 mg·L。提示建立的检测方法准确、快速，适用于异环磷酰胺、环磷酰胺血药浓度监测。

　　3 讨 论文献报道测定异环磷酰胺、环磷酰胺血药浓度样品预处理方法有采用固相萃取小柱萃取、氯仿萃取以及有用甲醇沉淀等方法。固相萃取小柱成本高，不利于大样本量的使用；甲醇沉淀方法使样本体积增大，方法灵敏度降低，难以满足低血药浓度的检测要求，考察用氯仿提取方法，发现提取过程出现大量乳化现象，氯仿处于下层，吸取操作不方便，试验结果图谱杂质多，色谱峰分离不理想，回收率不稳定。我们采用无水硫酸钠将血浆样品中异环磷酰胺、环磷酰胺脱水吸附，再用氯仿将异环磷酰胺、环磷酰胺从硫酸钠中提取，该提取方法将液一液提取转化为液 固提取，由于氯仿位于上层，操作方法简单，快捷、避免乳化，试验结果回收率高且稳定，许多杂质吸附在硫酸钠中，因此，试验结果图谱杂质少、色谱峰分离理想。

　　本试验建立的方法所需样本数少，样品处理简便、快速、灵敏度高，同时适用于异环磷酰胺、环磷酰胺血药浓度监测及药代动力学研究。

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