ASMT在抑郁行为及运动改善神经可塑性中的作用机制研究

发布时间：2020-04-09 12:42

【摘要】：背景:世界卫生组织(WHO)报告,抑郁症占据世界疾病负担总数的4.8%,至2030年将跃居为世界第一大负担疾病。因此,深入揭示抑郁症发生发展的致病机理以及发现抑郁症治疗的有效方法具有重要的社会、经济和医学意义。昼夜节律改变导致的睡眠障碍和褪黑素分泌紊乱是抑郁症的主要特征。褪黑素(melatonin,MT)主要由哺乳动物松果体分泌,具有明显的昼夜节律。5-羟色胺(serotonin,5-HT)、5-羟色胺-N-乙酰转移酶(serotonin N-acetyltransferase,SNAT)和N-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶(N-acetylserotonin methyltransferase,ASMT)是MT水平的重要调节因子。研究表明,ASMT基因多态性与抑郁症高度相关,运动则能通过调节MT及单胺类神经递质等机制缓解抑郁症状。因此,ASMT在抑郁发病机制以及运动干预中的作用值得进一步研究。目的:探究ASMT基因敲除是否导致小鼠的抑郁行为,并揭示运动对大脑神经可塑性的作用和机制,以期为运动干预抑郁症的机制研究以及抑郁症的临床研究提供新的靶点。方法:本实验选用雌性纯合子ASMT基因敲除小鼠15只,同窝野生型小鼠14只(背景均为C57BL/6小鼠),6-7周龄,体重24-25g。根据小鼠基因型分成四组,每组7-8只:(1)WT组(n=7),即野生控制组,正常饲养,不施加任何干预;(2)WE组(n=7),即野生运动组,实验小鼠6-7周龄时开始接受5周的游泳训练;(3)KO组(n=8),即基因敲除组,鉴定为ASMT基因敲除小鼠后,正常饲养,不施加任何干预;(4)KE组(n=7),即敲除运动组,ASMT基因敲除小鼠6-7周龄时开始接受5周的游泳训练。5周的运动干预后,各组小鼠接受抑郁行为学检测,行为学检测结束后,将小鼠麻醉取血和海马组织。检测血清5-HT、MT、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)的含量;采用电镜检测海马CA1区突触结构与数量;采用免疫荧光技术检测海马CA1区和齿状回区的神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、突触蛋白(synapsin,SYP)、生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)等神经可塑性标志蛋白表达情况。结果:1抑郁行为学实验结果显示,与WT组相比,KO组在糖水实验(SPT)中的糖水消耗量显著降低(P0.05),在强迫游泳实验(FST)中的不动时间显著增加(P0.05),挣扎时间非常显著减少(P0.01)在开场实验(OFT)中的中央路程显著减少(P0.05);与KO组相比,KE组在SPT中的糖水消耗量显著升高(P0.05)。2血清酶联免疫吸附实验结果显示,与WT组相比,KO组的MT血清含量下降但未达到显著性差异,去甲肾上腺素(NE)的血清含量显著上升(P0.05);与KO组相比,KE组的MT含量上升,但未达到显著性差异,5-HT含量显著增加(P0.05)。3电镜实验结果显示,与WT组相比,KO组海马CA1区PSD厚度显著下降(P0.05),而突触间隙的宽度非常显著升高(P0.01),突触数量显著下降(P0.05)。与KO组相比,KE组海马CA1区PSD厚度非常显著升高(P0.01),突触间隙宽度下降,但未达到显著性差异。4免疫荧光实验结果显示,与WT组相比,KO组在海马CA1v区NeuN表达显著下降(P0.05),在CA1d区GFAP表达显著升高(P0.05),在DG区GAP-43表达非常显著降低(P0.01),NeuN表达显著升高(P0.05),GFAP表达显著升高,WE组在海马CA1d区GFAP表达显著下降(P0.05)。与KO组相比,KE组在海马CA1v区GAP-43表达显著升高(P0.05),GFAP表达显著升高(P0.05),在CA1d区NeuN表达显著升高(P0.05),GFAP表达非常显著下降(P0.01),在GD区GAP-43表达显著升高(P0.05),NeuN表达显著下降(P0.05),GFAP表达显著下降(P0.05)。结论:(1)ASMT基因敲除可诱发小鼠抑郁行为,游泳运动对此有明显改善作用,且这种改善作用可能与血清MT和5-HT的水平有关。(2)ASMT基因敲除会使小鼠海马CA1区突触结构造成破坏,突触数量减少,游泳运动能一定程度上逆转突触结构上的改变。(3)ASMT基因敲除可总体下调GAP-43、NeuN、SYP,上调GFAP在海马CA1v、CA1d区与DG区的表达,游泳运动可一定程度上逆转这些变化,却进一步上调了CA1v区GFAP的表达。意义:本研究采用ASMT基因敲除小鼠作为动物模型,探讨了ASMT基因敲除导致的褪黑素分泌障碍是否会诱导小鼠产生抑郁行为,是对抑郁动物模型的新探索;其次以大脑神经可塑性作为切入点对ASMT基因敲除小鼠进行研究,探究运动干预作用对小鼠抑郁行为的影响极其机制,为运动抗抑郁作用提供更坚实的佐证。
【图文】：

褪黑素,大脑,血清,小鼠

华东师范大学 2019 届硕士学位论文9图1-1. 昼夜节律变化对血清褪黑素浓度以及大脑神经可塑性的影响Figure 1-1. Influence of circadian rhythm changes on serum melatonin concentration and brainneuroplasticity[106].2 材料与方法2.1 实验动物及分组由仁源生物技术（上海）有限公司采用 CRISPR 技术构建 ASMT 全身性因敲除小鼠，与野生型小鼠（背景均为 C57BL/6）并进行繁殖。待小鼠 3-4 周龄，体重 17-20g 时对同窝小鼠按性别分笼，打耳钉进行标记并将小鼠尾巴末端剪去 2mm 左右样本进行基因鉴定。此时进行标记、取材与分笼是因为小鼠达到断奶周龄，可以进食饲料，同时防止小鼠进一步成熟后发生交配行为；分笼与取材一次性完成也可减少对小鼠伤害的次数。通过基因鉴定最终选取 F3 代雌性性纯合子 ASMT 基因敲除小鼠 15 只，F3 代同窝野生型小鼠 14 只。随后所有小鼠还需进行适应性饲养 3 周，至小鼠体重达到 24-25g。

流程图,流程图

实验处理流程图
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：G804.2

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