骨骼肌特异性过表达PGC-1α模型建立及应用探讨

发布时间：2020-04-30 21:42

【摘要】：目的:本研究拟利用在体注射及电穿孔技术,建立FVB/N小鼠骨骼肌特异性过表达PGC-1α模型。研究方法:1.质粒转染效率鉴定:C2C12成肌细胞进行转染实验,利用Flag-PGC-1α质粒进行转染,转染48小时后,检测PGC-1α蛋白表达,鉴定质粒转染效率。2.骨骼肌质粒注射后时效性观察:雄性6-8月龄FVB/N小鼠,随机分成3组:转染5天组(简称5D),转染10天组(简称10D),转染15天组(简称15D),每组10只,检测PGC-1α蛋白的表达,确定骨骼肌质粒注射后的最佳检测时间。3.骨骼肌特异性PGC-1α过表达模型建立:雄性6-8月龄FVB/N小鼠,随机分成3组:对照组(空载质粒注射,称为Negative Control,简称NC),GFP组和Flag-PGC-1α质粒组,每组10只。Flag-PGC-1α质粒组胫骨前肌注射Flag-PGC-1α质粒(2μg/μl,40μl),并利用电穿孔法促进转染,GFP组胫骨前肌注射GFP质粒(2μg/μl,40μl)+电穿孔法促进转染,NC组胫骨前肌注射pUC DNA 3.1空载质粒(2μg/μl,40μl)+电穿孔法促进转染。注射后10天,将实验动物进行处死取材,提取胫骨前肌、心肌进行相关检测。4.骨骼肌特异性PGC-1α过表达模型鉴定:1)组织学检测(HE染色):分别对正常组(空白组)、NC组、Flag-PGC-1α组小鼠的胫骨前肌,进行HE染色,对其骨骼肌肌纤维进行病理学形态检测及分析。2)Western blot法检测胫骨前肌和心肌相关蛋白表达:PGC-1α、GFP、mtTFA、NF-κB、MnSOD、FNDC5。结果:1.Flag-PGC-1α质粒转染C2C12成肌细胞48h后,western blot结果显示,PGC-1α蛋白整体表达水平显著高于对照组,提示Flag-PGC-1α质粒转染效率较好。2.将5D、10D和15D三组小鼠胫骨前肌中PGC-1α蛋白表达量进行比较,10D组中PGC-1α蛋白表达水平最高,提示骨骼肌进行PGC-1α转染后第10天为最佳检测时间。3.对NC组和GFP组进行GFP蛋白表达分析,显示GFP蛋白在GFP组表达成功,而NC组没有表达。4.HE染色结果显示,Flag-PGC-1α注射组的肌纤维相对于NC组有趋于愈合的趋势。5.对实验小鼠的胫骨前肌进行蛋白水平检测,Flag-PGC-1α组中mtTFA蛋白表达水平相对于NC组有显著性升高;Flag-PGC-1α组与NC组相比,FNDC5蛋白表达水平显著性升高;NF-κB、MnSOD蛋白表达水平在各组之间没有显著性差异。6.对实验小鼠的心肌进行蛋白水平检测,与NC组相比,Flag-PGC-1α组中心肌FNDC5、mtTFA表达量显著性升高。结论:1.成功地建立了小鼠骨骼肌特异性过表达PGC-1α模型,表现为骨骼肌PGC-1α表达升高,其下游线粒体转录相关因子、肌肉因子相关蛋白表达升高。2.骨骼肌特异性过表达PGC-1α引起心肌线粒体生物合成相关蛋白表达升高,提示可能存在骨骼肌-心肌交互作用,具体机制有待进一步研究。
【图文】：

增强了 SIRT1 的活性。在饮食因素的作用下观察到类似的增进行的模型实验表明，身体活动增加了 NAD+的浓度并降低了-1α乙酰化水平[57]。两种机制调节骨骼肌细胞外 NAD+的水平，，A致 NAD+水平升高，SIRT1 活化增强 PGC-1α的转录活性[58]。N酰胺转化为 NAD+，并在训练过程中增强骨骼肌的这一过程[59]。通过分别和一起改变 AMPK 和 NAMPT 酶的活性来调节骨骼肌的增加，伴随着调节 SIRT1 活性。但是应注意，SIRT1 的活性不其底物的浓度而且可以通过翻译后修饰来调节。几项研究表明，增加了酶的脱乙酰酶活性[60,61]。脱乙酰酶 SIRT1 是 PGC-1α脱乙骼肌中诱导线粒体生物发生的调节剂，可导致 PGC-1α蛋白的活RT1 基因的小鼠实验表明，PGC-1α基因表达、蛋白质转运、活有改变。已经发现，代替 SIRT1，PGC-1α的脱乙酰化和蛋白质的活转移酶催化，这种酶可能是身体活动后 PGC-1α活化的重要调节

图 2 运动对 irisin 的调控[76]Irisin 是由 111 个氨基酸组成的可溶性 N-糖基化蛋白质激素，分子量约为 12KDa。Irisin 在进化上高度保守，小鼠和人 Irisin 序列同源性高达 100%。Irisin 与胰岛素、胰高血糖素和瘦素的同源性分别为 85%、90%和 83%[2]，如下图所示。由此提示，Irisin 可能是改善糖尿病、心衰等慢性疾病的新靶点。
【学位授予单位】：天津体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：G804.2

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本文编号：2646206