HaNACl基因转化马铃薯研究

发布时间：2017-09-22 10:11

  本文关键词：HaNACl基因转化马铃薯研究

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【摘要】：马铃薯(Solanum tuberosum L.)作为宁夏优势特色产业之一,对于促进当地区域经济健康发展起着重要的支撑作用。但马铃薯种植区多位于无灌溉、生态脆弱地区,干旱、盐渍等非生物胁迫严重影响马铃薯的产量与品质。植物的抗逆性属于复杂的数量性状,加之马铃薯属于同源四倍体植物,遗传背景狭窄,常规杂交育种短时期内很难创制出优良品种。基因工程育种技术的发展,为改良马铃薯抗逆能力,创制抗逆新品种提供了有效的途径。NAC转录因子参与植物形态建成,通过与DNA元件的结合调控下游一系列基因的表达,对非生物胁迫应答,尤其是对盐、干旱胁迫发挥着重要调节作用。因此,利用基因工程技术改良马铃薯的抗逆性,创制抗逆新品种具有重要研究意义。本实验以我区主栽马铃薯品种“陇薯3号”、“大西洋”、“费乌瑞它”、“夏波蒂”、“青薯168”和“黑美人”的叶片和茎段为材料,建立优化了离体再生体系和微型薯高效液体培养体系；采用正交设计研究了遗传转化体系中各影响因素的最佳水平,并确立了最优组合。在此基础上,利用农杆菌介导法将前期克隆得到的梭梭(Haloxylon ammodendron) HaNACl基因进行了马铃薯转化、阳性植株鉴定和抗逆株系筛选研究。主要研究结果如下：1.以6个品种的叶片和茎段为外植体,研究了植物激素组合对愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率及出苗率的影响程度。结果表明：MS培养基中添加01 mg·L-12,4-D+1.0mg·L-16-BA对愈伤组织诱导效果最佳,6个品种叶片愈伤组织的诱导率达73.3%-93.3%,茎段愈伤组织的诱导率达90.0%-100%。添加0.5 mg·L-11GA+2 mg·L-16-BA+3mg·L-1ZT可显著地促进茎段愈伤组织分化及出苗,其中,“陇薯3号”、“大西洋”的分化效果最佳,出苗率分别达到了175.0%和140.0%；2.确立了MS培养基中添加2mg·L-16-BA为试管薯诱导、生长的最佳液体培养体系。与固体培养体系相比,该体系大大缩短了诱导周期,结薯数量多且直径大。同时,研究并建立了以试管薯薄片为外植体的马铃薯高效受体体系,再生周期仅为20-30d。薯片在培养基(MS+1.0 mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.5mg·L-16BA+0.2mg·L-1GA)上出苗效果最好,其中“青薯168”出苗率最高,达到110%,“黑美人”次之为77.8%。3.利用农杆菌介导法将HaNAC1基因转化马铃薯,进行4因素3水平L9(34)的正交试验,研究结果表明,品种为“大西洋”,卡那霉素选择浓度30mg·L-1、菌液浓度OD600 10,浸染时间15 min,为最佳转化方案,转化率为35.9%。4.实验共筛选出220株抗性芽,112株通过了生根筛选,经PCR及RT-PCR检测：转基因阳性株系共55株,阳性转化率达到49.1%；从中抽取7株进一步进行PCR-Southern blot,结果验证外源HaNACl基因成功的整合到受体材料基因组中。5.以PEG-6000和NaCl分别人工模拟旱胁迫和盐胁迫,对受体材料和阳性转基因株系进行形态、生长指标调查。结果表明,有6株阳性转基因株系的抗旱性和耐盐性显著高于对照。生理检测结果进一步表明在逆境胁迫处理下,外源HaNACl基因的导入能显著地提高马铃薯转基因植株的抗逆性。
【关键词】：马铃薯 HaNACl基因 遗传转化 阳性株系
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S532
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 文献综述9-19
• 1.1 研究背景9
• 1.2 干旱对马铃薯生产的影响9-11
• 1.3 NAC转录因子的研究进展11-15
• 1.4 马铃薯遗传转化体系影响因素15-16
• 1.5 马铃薯抗逆基因工程研究进展16-17
• 1.6 本研究的目的意义和技术路线17-19
• 第二章 抗逆基因的选择与植物表达载体的构建19-23
• 2.1 材料与试剂19-20
• 2.2 方法20-22
• 2.3 结果22
• 2.4 讨论22-23
• 第三章 马铃薯转化受体体系的建立研究23-31
• 3.1 材料与试剂23
• 3.2 方法23-25
• 3.3 结果25-30
• 3.4 讨论30-31
• 第四章 马铃薯遗传转化体系的建立研究31-36
• 4.1 材料31-32
• 4.2 方法32-33
• 4.3 结果33-34
• 4.4 讨论34-36
• 第五章 转基因植株的分子生物学检测及抗旱耐盐性鉴定36-53
• 5.1 材料与试剂36
• 5.2 方法36-42
• 5.3 结果42-51
• 5.4 讨论51-53
• 第六章 结论53-54
• 参考文献54-60
• 致谢60-61
• 个人简历61
• 攻读硕士期间发表的论文61

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本文编号：900216