生物活性蛋白导向简易构建新型高效安全的纳米探针用于肿瘤的诊疗

发布时间：2018-04-03 18:15

本文选题：透明质酸　切入点：转铁蛋白　出处：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分简单制备的具有内源性生物相容性的透明质酸和转铁蛋白共修饰的Fe_3O_4纳米颗粒用于活体肿瘤双靶向磁共振成像【目的】使用纳米探针来诊断临床恶性肿瘤需要满足苛刻的诊断敏感性及生物安全性方面的要求。整合双靶标修饰和选择内源性元素及生物分子作为原始材料的策略在构建高灵敏度及良好生物相容性的纳米平台方面展现了巨大的潜能。为了实现上述设计策略,我们构建了一种基于内源性透明质酸分子(Hyaluronic acid,HA)和转铁蛋白分子(Transferrin,Tf)共修饰的具有良好生物相容性的双靶向Fe_3O_4纳米粒子用于活体肿瘤靶向磁共振成像。【方法】以HA同时作为模板和靶向分子,通过一步共沉淀的方法合成Fe_3O_4@HA纳米颗粒,接着该纳米颗粒又被进一步修饰了Tf,最终合成Fe_3O_4@HA@Tf纳米颗粒并进行表征。通过细胞MTT实验、活体生化分析、活体代谢及体重监测来研究该纳米探针的细胞毒性及活体毒性。采用细胞靶向封闭吞噬实验及活体肿瘤模型核磁共振成像实验来考察该纳米探针的细胞及活体肿瘤靶向能力。【结果】该纳米探针合成简单、条件温和,具有出色的磁共振T2加权对比成像的能力。MTT实验、活体生化分析及体重监测证明该纳米探针具有较低的细胞毒性和活体毒性。活体代谢监测证明了该纳米探针具有明确的肝脏代谢途径。细胞靶向封闭吞噬实验及活体肿瘤模型核磁共振成像实验展示了该纳米探针出色的细胞靶向识别及活体肿瘤靶向成像能力。【结论】本研究发展了一种双靶向的Fe_3O_4纳米探针,该探针合成步骤简单,拥有极佳的生物相容性和出色的肿瘤靶向核磁共振成像诊断功能,具备应用于临床肿瘤诊断的巨大潜力。更重要的是,这种将双靶标策略和生物内源性元素、分子整合的设计为构建高效、生物友好的肿瘤靶向诊断的纳米平台提供了新的思路。第二部分模仿药物-底物相互作用:一种通用的构建多功能诊疗纳米探针的新型仿生技术【目的】从古至今,仿生技术的发展为推动科技的进步做出了突出贡献。生物医学领域内也亟需一种普适性的仿生策略用来构建高效生物纳米探针。通过模拟高锰酸钾消毒过程,考察模仿药物-底物相互作用这一仿生策略用于构建多功能肿瘤诊疗纳米探针的可行性。【方法】通过模拟高锰酸钾的消毒过程合成牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)包覆的二氧化锰(MnO_2)纳米颗粒,并对BSA-MnO_2纳米颗粒进行一系列表征。通过细胞MTT、活体代谢、体重监测、组织病理学切片观察、生化指标分析综合评估BSA-MnO_2纳米颗粒的细胞毒性及活体毒性。通过正常小鼠和荷瘤小鼠的活体MR成像,分别考察BSA-MnO_2纳米颗粒的肾脏成像以及肿瘤靶向成像能力。为了进一步拓展BSA-MnO_2纳米平台的多功能性,两种FDA批准使用的药物吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)和紫杉醇(Paclitaxel,PTX)被分别以简单、节能的方法负载到BSA-MnO_2纳米平台,从而形成了两种诊疗一体化的纳米探针BSA-MnO_2-ICG(BMI)和BSA-MnO_2-PTX(BMP),分别用于MR成像引导下的肿瘤光热治疗与化疗。为了进一步验证模拟药物-底物相互作用这一仿生策略用于构建多功能肿瘤诊疗探针的可行性,分别以转铁蛋白(Tf)和卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)和高锰酸钾反应生成不同蛋白包覆的MnO_2纳米颗粒,并进行表征和正常活体MR成像。【结果】所得BSA-MnO_2纳米颗粒拥有小于10 nm的粒径、出色的单分散性、良好的水溶性以及高达7.9 m M-1s-1的T1弛豫率。一系列毒性评估实验表明该纳米颗粒具有极佳的生物相容性。活体MR成像展示了BSA-MnO_2纳米颗粒优越的肾脏和肿瘤靶向MR成像能力。基于BSA-MnO_2纳米平台进一步拓展的BMI和BMP纳米颗粒具有良好的肿瘤光热治疗以及化疗能力。此外BMI纳米颗粒的T1弛豫率高达70.6 m M-1s-1,而且其他双亲性小分子也能达到类似明显提高T1弛豫率的效果。采用Tf和OVA同样能合成具有较高T1弛豫率的MnO_2纳米颗粒并能实现良好的活体MR成像效果。【结论】通过模拟高锰酸钾的消毒过程合成的纳米颗粒不仅具有诸多优良的化学特性和良好的肾脏以及肿瘤靶向MR成像能力,还能通过负载治疗分子拓展成高效肿瘤靶向的诊疗试剂。另外本研究提出的模拟药物-底物相互作用的合成策略可以推广至许多其他生物活性分子,从而构建更多功能丰富的诊疗探针。第三部分抗原引导下合成的具有超高抗原负载率的OVA-ICG纳米疫苗用于树突状细胞激活和示踪以及成像引导下的光热-免疫联合抗肿瘤治疗【目的】针对目前多功能肿瘤纳米疫苗产量较低、抗原负载率有限、制备过程冗杂、结构和成分不确定以及潜在的系统毒性等不足,本研究提出了一种抗原引导下的纳米疫苗合成策略并合成了一种具有光热-免疫联合治疗功能的肿瘤纳米疫苗。【方法】利用卵清白蛋白(OVA)和吲哚菁绿(ICG)之间的疏水结合自组装合成OVA-ICG纳米疫苗,并对其进行一系列表征。通过细胞MTT、细胞吞噬、细胞因子检测及流式细胞检测分析OVA-ICG纳米疫苗的细胞毒性以及对树突状细胞(DC)的免疫激活作用。通过光热升温以及肿瘤细胞光热消融,考察OVA-ICG纳米疫苗的体外光热杀伤效果。将OVA-ICG纳米疫苗应用于活体抗肿瘤治疗,考察OVA-ICG纳米疫苗的光热-免疫协同治疗效果。通过提前对小鼠皮下注射OVA-ICG纳米疫苗,再接种肿瘤细胞,评估该纳米疫苗的肿瘤预防效果。将经OVA-ICG纳米疫苗标记的树突状细胞注射到小鼠皮下,观察该纳米疫苗的荧光免疫示踪能力。【结果】OVA-ICG纳米疫苗合成过程极其简单,不添加任何有毒试剂,也不需要苛刻的反应条件。OVA-ICG纳米疫苗中抗原负载率高达80.8%,并且具有出色的水溶液稳定性、良好的可重复性以及可冻干保存的特点,便于实现大量生产以及长期存储。该纳米疫苗不仅能在体外有效激活树突状细胞并可以作为高效光热材料杀伤黑色素瘤细胞,而且可以用于活体DC近红外荧光示踪以及光热-免疫联合杀伤肿瘤实体及残存瘤块。另外,OVA-ICG纳米疫苗具有很好的肿瘤预防功能。【结论】本次研究中,我们首次提出了这种抗原介导的纳米疫苗的合成策略,而且OVA-ICG纳米疫苗也是目前最简单的基于免疫治疗的多功能抗肿瘤试剂。更重要的是,这种步骤简单、环境友好、不添加有毒试剂的疫苗合成方法为人们构建其他新型多功能抗肿瘤疫苗提供了新的思路,同时此类疫苗的高度可重复性也增加了将来的临床转化和大规模生产的可能性。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R73-3;TB383.1

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