阳离子化金纳米簇的制备及其化学发光催化活性的研究

发布时间：2020-05-27 06:25

【摘要】：化学发光(Chmiluminescence,CL)是化学反应中反应产物在反应中获得能量,生成激发态中间产物,中间产物从激发态回到基态时产生的光辐射。化学发光反应的强度与反应中的反应物浓度有关,利用此原理,人们用化学发光强度来确定检测物含量,即化学发光分析方法。化学发光分析法具有分析过程快、灵敏度高、线性范围宽和操作过程简单等优点,已经被广泛应用于生物分析、环境分析、临床分析等领域。近年来,化学发光分析法也被应用于生物分子的检测,例如:抗原、抗体、特定序列DNA、酶等。目前,常用的化学发光体系主要有鲁米诺(luminol)、光泽精、过氧草酸酯、三联吡啶钌化学发光体系等。其中,鲁米诺是其中应用最为广泛的化学发光试剂之一。在碱性条件下,鲁米诺可以被不同的氧化剂氧化,生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸(3-aminophthalate,3-APA*),3-APA*从激发态回到基态时,释放出最大波长位于425nm处的化学发光。鲁米诺-过氧化氢体系是最为常见的鲁米诺化学发光体系,其在没有催化剂存在时化学发光信号较弱,在加入催化剂后化学发光信号明显增强。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)是一种天然的过氧化物酶,它可以显著提高鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的化学发光强度。HRP的催化活性较高,目前已被广泛应用于化学发光免疫分析,但是HRP作为天然酶有分离步骤较复杂,活性不稳定,价格较高等缺点。因此,近年来发展新型的拟过氧化物酶已逐渐成为研究的热点。纳米材料模拟酶以其高稳定性、低消耗、易于制备等优点成为拟过氧化物酶研究的热点。许多纳米材料,例如金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、金属硫化物纳米颗粒、碳材料、复合纳米颗粒等均被发现具有拟过氧化物酶活性。研究表明,纳米过氧化物模拟酶的催化活性与其粒径大小有关,粒径较小的纳米粒具有更高的催化活性。金纳米簇(Gold nanoclusters,Au NCs)是一种新型的纳米材料,与金纳米粒子相比,金纳米簇具有较小的体积、良好的稳定性,并且具有荧光特性。因此,课题选择金纳米簇为研究对象。在2008年,Ying课题组报道了以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)作为模板分子合成水溶性金纳米簇。所制备的BSA-金纳米簇具有良好的生物相容性,并且BSA模板为进一步对金纳米簇进行表面修饰提供了修饰位点。Wang课题组报道了BSA-金纳米簇与天然酶HRP相比对底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)有更高的亲和性。Chen课题组报道了以BSA为模板的金纳米簇可以在碱性条件下催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应,催化机理显示,金纳米簇可以催化过氧化氢分解产生大量活性中间体(例如:羟基自由基和超氧阴离子),羟基自由基和鲁米诺分子反应产生鲁米诺自由基,鲁米诺自由基与超氧阴离子自由基反应产生不稳定的中间体:激发态的3-APA*,激发态的3-APA*回到基态时最终产生化学发光。虽然金纳米簇已被报道具有化学发光催化活性,但与HRP相比其催化活性还较低。纳米模拟酶的催化活性除了与其粒径相关,还与纳米酶的表面性质有关。2009年,Prescott课题组报道影响氧化铁纳米粒子的拟过氧化物酶活性的主要因素是纳米粒子的表面电荷及其与底物的亲和性。Huang课题组报道了壳聚糖修饰的CoFe_2O_4纳米粒子比未修饰的CoFe_2O_4纳米粒子对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系具有更高的催化活性,这可能源自于带正电荷的壳聚糖与底物鲁米诺有更高的亲和性。Huang课题组还合成了以Al_2O_3为支持物的CoFe_2O_4纳米粒子,当其在一定pH值条件下带最高正电荷时,显示了最高的化学发光催化活性。受以上工作的启发,论文致力于研究金纳米簇表面性质对其化学发光催化活性的影响,以获得具有高效化学发光催化活性的金纳米簇。经过文献调研,我们发现目前用于化学发光催化活性研究的金纳米簇,都是以BSA为模板的金纳米簇。BSA-金纳米簇等电点在4.5左右,其在碱性的化学发光测定条件下带负电荷,与同在碱性条件下带负电荷的底物鲁米诺阴离子静电相斥,亲和性不高。我们推测BSA-金纳米簇在测定条件下带负电荷,与底物鲁米诺阴离子的亲和性差,是导致金纳米簇化学发光催化活性不高的原因之一。因此,课题以金纳米簇为研究对象,通过对其进行表面修饰以及模板分子的变化,制备了两种阳离子化的金纳米簇,以期增加金纳米簇与底物鲁米诺的亲和性,从而提高金纳米簇的在luminol-H_2O_2化学发光反应中的催化活性。在第二章中,我们采用后修饰法制备了阳离子化金纳米簇,以未修饰金纳米簇为对照,研究了表面电荷对金纳米簇化学发光催化活性的影响。研究内容详述如下:通过EDC反应,我们将乙二胺修饰在以BSA为模板的金纳米簇表面。修饰后的阳离子化金纳米簇具有良好的分散性,高倍透射电镜结果显示阳离子化金纳米簇的大小在1.8到2.9纳米之间。Zeta电位测定显示未修饰的BSA-金纳米簇等电点在4.5左右,当溶液的pH值大于5时,BSA-金纳米簇带负电荷;修饰后的阳离子化金纳米簇的等电点则显著提高,溶液pH在4到9范围内,阳离子化金纳米簇均带正电荷。在pH为9的测定条件下,将未修饰的BSA-金纳米簇加入到鲁米诺-过氧化氢体系中,该体系的化学发光强度增强了21倍;平行试验中,将阳离子化金纳米簇加入鲁米诺-过氧化氢体系后,该体系的化学发光强度增强了170倍。以上结果表明阳离子化金纳米簇相较于未修饰的金纳米簇具有更高的化学发光催化活性。我们分别优化了luminol-H_2O_2-金纳米簇和luminol-H_2O_2-阳离子化金纳米簇的化学发光测定条件,在优化的实验条件下,触发化学发光反应所需的阳离子化金纳米簇的检测限为14 nM,而对未修饰的BSA-金纳米簇的最低浓度为110 nM,表明阳离子化金簇在催化鲁米诺-过氧化氢反应中灵敏度提升了约10倍。化学发光催化机理研究显示,阳离子化金纳米簇能催化过氧化氢分解,产生多种含氧自由基,并且与未修饰金纳米簇相比,阳离子化金纳米簇更有利于单线态氧的生成。除此之外,动力学研究显示,金纳米簇催化luminol化学发光反应的米氏常数(K_m)为2.085,阳离子化金纳米簇催化luminol化学发光反应的Km值为1.182。以上结果表明,阳离子化金纳米簇较未修饰金纳米簇对底物luminol阴离子具有更高的亲和性。综合以上结果,我们推测在阳离子化金簇表面或周围能产生大量的单线态氧,并且在化学发光反应的最佳pH条件下,底物鲁米诺分子带负电荷,负电荷的鲁米诺分子与带正电荷的阳离子化金纳米簇相互作用更强,有利于单线态氧与鲁米诺阴离子作用产生更多的3-APA*,最终产生更强的化学发光。此外,我们也以2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)为底物,比较了阳离子化金纳米簇和未修饰金纳米簇在不同pH条件下的拟过氧化物酶活性。当pH为5时,阳离子化金纳米簇的催化活性是未修饰的金纳米簇的2倍。而当pH为6和7时,未修饰的金纳米簇对ABTS反应几乎没有催化活性,而阳离子化金纳米簇仍然可以催化H_2O_2氧化ABTS产生特征的颜色反应。我们推测这是由于阳离子化金纳米簇在测定pH 5-7下带正电荷,相较于带负电荷的BSA-金纳米簇,其与带负电荷的底物ABTS有更好的亲和性,所以阳离子化金纳米簇在pH 5-7均显示了良好的催化活性。稳定性实验中,我们考察了天然酶HRP、未修饰的BSA-金纳米簇和阳离子化金簇对温度的耐受性。将天然酶HRP、未修饰的BSA-金纳米簇和阳离子化金簇在不同温度下处理2 h后,测定其催化产生的化学发光强度。结果显示,未修饰的金纳米簇和阳离子化的金纳米簇在经过20-80℃处理后均具有稳定的化学发光催化活性。而天然酶HRP在经过30℃以上的预处理后,催化活性逐渐降低。以上结果表明,纳米过氧化物酶较天然过氧化物酶具有更好的热稳定性。综上,阳离子化金簇较未修饰金纳米簇具有更好的化学发光催化活性,且具有良好的热稳定性,其在化学发光分析、生物分析和环境化学等方面具有良好的应用前景。除此之外,本研究采用后修饰法制备阳离子化金簇,以提高其化学发光催化活性,本方法为提高其他纳米簇、纳米微粒拟过氧化物酶的化学发光催化活性提供了新的途径。聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是一种带正电荷的支链聚胺化合物。PEI具有大量伯胺、仲胺和叔胺基团,可与金属离子进行螯合,是一种纳米微粒表面阳离子化修饰的常用材料。在第三章中,我们选择PEI作为模板,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)为还原剂,参考文献方法以一步法制备了PEI阳离子化金纳米簇。相较于第二章的后修饰法制备阳离子化金簇,该方法以带正电荷的PEI为模板直接合成阳离子化金纳米簇,不需要在已经合成的金纳米簇表面进行再修饰,具有步骤简单、快速的优点。研究内容详述如下:我们以所制备得到PEI-金纳米簇的化学发光催化活性为指标,优化了PEI金纳米簇的制备条件,包括反应时间、反应温度、PEI用量、PEI分子量以及GSH/[AuCl]~-摩尔比等。在最佳实验条件下,我们制备得到PEI阳离子化金纳米簇,并分别采用紫外可见分光光度法、荧光分光光度法、高倍透射电镜、zeta电位等对其进行了表征。高倍透射电镜结果显示,合成的PEI阳离子化金纳米簇粒径小于2 nm,呈球状并且具有较好的分散性。Zeta电位显示PEI阳离子化金纳米簇在溶液pH值小于11时均带强烈的正电荷。荧光光谱显示,PEI阳离子化金纳米簇在280 nm处激发时,荧光发射波长位于800 nm左右产生了一个较强的荧光峰。化学发光分析显示,以PEI为模板制备的阳离子化金纳米簇能催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应产生慢化学发光信号。luminol-H_2O_2体系中加入PEI阳离子化金纳米簇后,体系化学发光信号缓慢增强,并在约600 s达到最强,与空白相比PEI阳离子化金纳米簇催化所产生的化学发光强度增强了38倍。化学发光光谱分析显示,luminol-H_2O_2-PEI阳离子化金纳米簇化学发光体系的最大发射波长位于425 nm,与luminol-H_2O_2-阳离子化BSA金纳米簇化学发光体系类似,发光物仍旧是激发态的3-APA*,体系中没有产生新的发光物。为研究PEI阳离子化金纳米簇催化luminol-H_2O_2体系产生化学发光的机理,我们将多种自由基淬灭剂引入到了化学发光反应中,包括叠氮化钠、DMSO、氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium blue chloride,NBT)等。我们将此体系的淬灭实验结果与第二章中的自由基淬灭实验进行了比较,两种阳离子化金纳米簇催化的luminol-H_2O_2反应显示了相似的自由基淬灭结果。与阳离子化BSA-金纳米簇相似,羟基自由基和单线态氧在化学发光体系中扮演了重要的角色。我们推测大量单线态氧在PEI阳离子化金纳米簇表面或周围产生,由于阳离子化金簇表面的正电荷,使得负电荷的luminol阴离子与PEI阳离子化金纳米簇有强的相互作用,促进单线态氧氧化luminol阴离子产生大量的激发态的3-APA*,从而得到增强的化学发光信号。同时,PEI阳离子化金纳米簇也可以催化ABTS反应产生颜色反应。表观动力学参数显示,在以ABTS为底物时,PEI金纳米簇催化的K_m值明显小于天然酶HRP。表明PEI阳离子化金纳米簇相较于HRP对于带负电荷的底物ABTS有更高的亲和性。除此之外,干扰实验显示,1 mM的Na~+、K~+、HPO_4~(2-),、H_2PO_4~-、Ca~(2+)、Ba~(2+)、Li~+,0.1 mM的Fe~(2+)、Mn~(2+)、Cd~(2+),0.01 mM的Cu~(2+)、Cr~(3+)、Fe~(3+)、Ni~(2+),和1μM的Ag~+,Co~(2+)对luminol-H_2O_2-PEI阳离子化金纳米簇化学发光体系无干扰。总之,我们用两种方法合成了阳离子化金纳米簇。增加了金纳米簇与底物luminol的亲和性,从而提高金纳米簇的在luminol-H_2O_2化学发光反应中的催化活性。为制备高催化活性的纳米微粒拟过氧化物酶提供了更多方式。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TB383.1;O643.36

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