自组装多酶纳米反应器的设计与构建

发布时间：2020-10-21 06:31

　　 在细胞代谢活动中,多酶级联反应体系通过将不同类型酶分子精准、有序地自组装,形成多酶复合体,使得酶分子在空间上互相邻近,形成底物通道,从而増强级联酶反应的协同作用和催化效率。模拟和借鉴天然多酶复合体的组装策略,构建高效、稳定的人工多酶纳米反应器已成为合成生物学与代谢工程的重要研究方向。但是,由于代谢途径中酶分子结构和功能的复杂性,多酶反应器的构建仍面临诸多挑战,如稳定性弱、组装层次较低、可控性差等,严重限制了多酶分子机器在生物合成中的应用。本文针对上述问题,基于SpyCatcher/SpyTag自反应共价偶联系统,选择氧化还原酶-辅酶循环体系为模式系统,设计了兼具催化活性和自组装能力的功能酶分子模块,并深入研究了多酶体系在二维(2D)和三维(3D)层次的共价组装和催化性能,以探索新型SpyCatcher/SpyTag共价偶联系统在多酶体系构建中的应用潜力,并开发高效的纳米多酶纳米分子机器用于更多有价值生物产品的合成。具体研究如下:(1)2D辅酶循环机器的组装:寡聚酶广泛存在于代谢通路中,由于其结构和功能的复杂性,多酶系统的有序及稳定组装仍然面临挑战。本研究中,我们选择二聚体的细胞色素单加氧酶P450BM3突变体(P450BM3m,A74G/F87V/L188Q)和四聚体的葡萄糖脱氢酶(GDH)作为辅酶循环模式系统,基于SpyCatcher/SpyTag的自反应共价偶联特性和无骨架自组装技术,构建葡萄糖和NADP~+驱动的辅酶循环机器,用于染料靛蓝的高效合成。首先通过基因融合技术构建了具有生物催化和自组装能力的双功能催化模块SpyCatcher-P450BM3m和SpyTag-GDH;将纯化的两个模块在体外混合,通过SpyCatcher与SpyTag共价偶联一步实现了多酶纳米反应器的自组装;使用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)等分析证明多酶反应器形成了高度有序的二维纳米片层,大小在几十到几百个微米;生化实验分析表明:2D辅酶循环机器的催化速率比未组装多酶混合物提升了2-3倍,同时展现出更好的热稳定性、储藏稳定性及可反复使用性。(2)3D辅酶循环机器的可控组装:鉴于3D层次的多酶催化剂具有更高效的中间产物传输效率等潜在优势,我们探索了将具有3D拓扑结构的大肠杆菌DNA结合蛋白(DNA binding protein,Dps)与SpyCatcher/SpyTag系统相结合的新型3D辅酶循环机器构建。我们选择乙醛还原酶(ALR)和甲酸脱氢酶(FDH)构成辅酶循环系统、以期使用廉价底物甲酸和4-氯乙酰乙酸乙酯合成药物手性砌块分子4-氯-3羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)。首先将大肠杆菌DNA结合蛋白Dps骨架蛋白和SpyCatcher/SpyTag相互作用元件分别与两个酶进行融合,构建了三元件SpyTag-Dps-ALR融合蛋白和二元件SpyCatcher-FDH融合蛋白;凝胶排阻色谱(SEC)、电泳迁移实验(EMSA)、以及TEM等研究结果表明:三元件融合蛋白SpyTag-Dps-ALR在大肠杆菌中成功自组装为单分散的3D建筑模块。通过在体外与SpyCatcher-FDH混合,可一步实现双酶模块在三维空间的自组装。组装模式分析表明:1分子SpyTag-Dps-ALR最多可以与12分子的SpyCatcher-FDH进行组装;使用AFM对组装体结构进行表征,表明两个融合蛋白模块在SpyCatcher/SpyTag相互作用的驱动下,沿三维方向生长,形成微米级的3D超分子催化网络;对组装体的催化性能进行分析,发现:1)在甲酸和NADP~+驱动下,能有效实现辅酶再生并合成R-CHBE;2)使用辅因子NADP~+进行合成反应比使用NADPH具有更高的辅酶循环优势;3)SpyTag-Dps-ALR与SpyCatcher-FDH组装比为1:12时形成的纳米反应器,将辅酶循环效率提高了10倍;4)多酶催化剂具有良好的反复使用能力,反复使用6次具有80%以上活力;使用10次后仍具有50%以上活力。表明3D辅酶循环机器通过可控自组装可以实现高效的辅酶循环和产物合成。本研究首次探索了SpyCatcher/SpyTag化学在多酶催化领域的应用。成功构建了具有2D结构的氧化还原酶-辅酶循环机器,证明SpyCatcher/SpyTag系统与多亚基蛋白具有良好兼容性,为发展稳定、高效的多酶反应器提供了新的策略。本研究所构建的3D辅酶循环机器,实现了多酶体系在三维空间的可控、有序组装,促进了手性化合物的高效、稳定合成。证明了Dps蛋白作为空间支架的可行性,本论文所建立的高效、稳定、多层次的纳米多酶反应器的设计思路,实现了酶分子机器设计的模式创新,为重要化合物的高效合成提供了理论和技术支撑。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TB383.1;Q814
【部分图文】：

图 1.1 聚酮合酶结构示意图[15]酮基合成酶(Ketosynthase, KS), 酰基转移酶(Acyltransferase, AT), (Acyl Carrier Protein，ACP), 酮基还原酶(Ketoreductase，KR)和(Enoyl Reductase, ER)。Figure 1.1 The structure and mechanism of polyketide synthas纤维素小体（cellulosome）是锚定在厌氧细菌细胞壁上的超分子是一个研究较为清楚和成熟的天然多酶催化机器[17-19]，纤维小体是纤维素结合结构域（CBM）和多拷贝的粘连蛋白 cohesin 结构域组素水解酶类通常含有一个与 cohesin 结构域高度亲和的 dockerin cohesin-dockerin 之间的相互作用，将多个纤维素类水解酶组共装到形成超分子纤维素水解机器，能够有效促进水解酶类的协同催化，

图 1.2 厌氧菌纤维素小体机器[17]ScaA: 基础骨架（I 型）；ScaC，ScaD, ScaF：锚定骨架（II 型）；ScaB：接头骨架； CBM：碳水化合物结合模块；GH：糖苷水解酶。Fig 1.2 Natural protein scaffolds from cellulosome研究表明，细胞代谢活动中的不同功能酶分子可以组装形成精确有序的多酶催化机器，通过高度的协同作用，高效的实现了细胞生命活动的正常运转，因此深入研究天然多酶复合体的组装结构和催化机制，通过人工模拟和借鉴，精确的设计，将多个酶分子组装成多酶催化机器，实现高效的协同催化成为合成生物学和代谢工程领域富有挑战性的研究方向之一[20,21]。1.1.2 多酶复合体的作用机制目前研究普遍认为，细胞内多酶复合体系整体高效的催化能力可能归因于[22-26]

上海交通大学博士学位论文phimurium 来源的色氨酸合酶的结构解析发现[27]，该酶以 α2β２四聚体的形式存在，α 亚基催化 3-磷酸甘油吲哚裂解为 3-磷酸甘油醛和吲哚，β 亚基催化吲哚和Ｌ-丝氨酸合成Ｌ-色氨酸。蛋白 α，β 亚基间距离为 25 ,中间有一个疏水底物传递通道。在级联催化反应的不同步骤，通过变构调节活性位点区域的开关，控制底物的运输和传递。为了确认该底物通道的存在，研究者从酶反应动力学、蛋白晶体结构等方面入手做了大量研究工作。Ahmed 研究组通过稳态实验得到了底物通道存在的证据[28-30]，在色氨酸的合成过程中，只能检测到微量的吲哚，约为３-磷酸甘油醛浓度的１％，而且检测不到色氨酸合成的延滞时间。动力学分析实验结果示，吲哚从 α 亚基的活性位点移动到 β 亚基的活性位点，并在 β 亚基上快速转化为 L-色氨酸（图 1.3）。
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本文编号：2849773